Optisen mikroskoopin tärkein havainnointimenetelmä on fluoresenssihavainto
Fluoresenssi-ilmiö
Fluoresenssi viittaa prosessiin, jossa fluoresoiva aine säteilee pidemmän aallonpituuden valoa lähes samanaikaisesti, kun sitä säteilytetään tietyn aallonpituuden omaavalla valolla (kuva 1). Kun tietyn aallonpituuden (viritysaallonpituuden) valo osuu molekyyliin (kuten fluoroforissa olevaan molekyyliin), molekyylin elektronit absorboivat fotonienergian. Seuraavaksi elektronit siirtyvät perustilasta (S0) korkeammalle energiatasolle, viritettyyn tilaan (S1'). Tätä prosessia kutsutaan viritykseksi①. Elektroni pysyy viritetyssä tilassa 10-9–10-8 sekuntia, jonka aikana elektroni menettää jonkin verran energiaa ②. Viritystilasta (S1) poistuttaessa ja perustilaan ③ palatessa vapautuu jäljellä oleva viritysprosessin aikana absorboitunut energia.
Fluoresoivan molekyylin viipymäaika viritetyssä tilassa on fluoresenssin elinikä, yleensä nanosekunteina, mikä on itse fluoresoivalle molekyylille ominaista ominaisuus. Fluoresenssin elinikää käyttävää kuvantamistekniikkaa kutsutaan Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -tekniikaksi, joka voi suorittaa syvempiä toiminnallisia ja tarkempia mittauksia fluoresenssin intensiteetin kuvantamisen lisäksi molekyylirakenteen, molekyylien välisten vuorovaikutusten ja molekyylien mikroympäristöjen saamiseksi. tietoja, joita on vaikea saada tavanomaisella optisella kuvantamisella.
Toinen tärkeä fluoresenssin ominaisuus on Stokes-siirtymä, viritys- ja emissiohuippujen välinen aallonpituusero (kuva 2). Yleensä emissiovalon aallonpituus on pidempi kuin viritysvalon aallonpituus. Tämä johtuu siitä, että kun fluoresoiva aine on viritetty ja ennen kuin fotoni vapautuu, elektronit menettävät osan energiasta rentoutumisprosessin kautta. Fluoresoivia aineita, joilla on suurempi Stokes-siirtymä, on helpompi havaita fluoresenssimikroskoopilla.
Fluoresenssimikroskoopit ja fluoresenssisuodatinlohkot
Fluoresenssimikroskopia on optinen mikroskooppi, joka käyttää fluoresenssiominaisuuksia havainnointiin ja kuvaamiseen, ja sitä käytetään laajasti solubiologiassa, neurobiologiassa, kasvitieteessä, mikrobiologiassa, patologiassa, genetiikassa ja muilla aloilla. Fluoresenssikuvauksen etuna on korkea herkkyys ja korkea spesifisyys, ja se soveltuu erittäin hyvin spesifisten proteiinien, organellien jne. jakautumisen tarkkailuun kudoksissa ja soluissa, yhteislokalisaation ja vuorovaikutuksen tutkimukseen sekä elämändynamiikan seurantaan. prosesseja, kuten muutoksia ionipitoisuudessa.
Suurin osa solujen molekyyleistä ei fluoresoi, ja niiden näkeminen edellyttää fluoresoivaa leimaa. On olemassa monia fluoresoivan leimauksen menetelmiä, jotka voidaan leimata suoraan (kuten DAPI:n käyttö DNA:n leimaamiseen), tai immunovärjäys käyttämällä vasta-aineiden antigeeniä sitovia ominaisuuksia, tai kohdeproteiini voidaan leimata fluoresoivilla proteiineilla (kuten GFP, vihreä fluoresoiva proteiini) tai palautuva sitoutuminen. synteettiset väriaineet (kuten Fura-2) jne.
Tällä hetkellä fluoresenssimikroskoopista on tullut eri laboratorioiden ja kuvantamisalustojen vakiokuvauslaitteisto ja se on hyvä apu päivittäisiin kokeisiin. Fluoresenssimikroskoopit jaetaan pääasiassa kolmeen luokkaan: pystyfluoresenssimikroskoopit (sopii leikkaamiseen), käänteiset fluoresenssimikroskoopit (sopii eläville soluille, ottaen huomioon leikkeet), fluoresoivat stereoskooppiset mikroskoopit (sopii suuremmille näytteille, kuten kasveille, seeprakalalle (aikuinen/ alkio), medaka, hiiren/rotan elimet jne.).
Fluoresenssisuodatinlohko on mikroskooppien fluoresenssikuvauksen ydinkomponentti. Se koostuu virityssuodattimesta, emissiosuodattimesta ja dikroisesta säteen jakajasta. Se asennetaan suodatinpyörään, kuten Leica DMi8:aan, joka on varustettu 6-asentosuodatinpyörällä (kuva 3). ). Eri mikroskoopeilla on erilaiset pyörien asennot, ja joissakin mikroskoopeissa käytetään suodatinlevyjä.
Suodatinlohkolla on tärkeä rooli fluoresenssikuvauksessa: virityssuodatin valitsee viritysvalon näytteen virittämistä varten ja estää muut valon aallonpituudet; virityssuodattimen läpi kulkeva valo kulkee dikroisen säteenjakajan läpi (sen tehtävänä on heijastaa viritysvaloa ja välittää fluoresenssia), heijastuksen jälkeen se fokusoidaan objektiivilla, säteilytetään näytteeseen ja vastaava fluoresenssi viritetään säteilee valoa. Objektiivin linssi kerää säteilevän valon, kulkee dikroisen säteen jakajan läpi ja saavuttaa emissiosuodattimen. Kuten kuvassa 4: viritysaallonpituus on 450-490nm, dikroinen säteenjakaja heijastaa valoa lyhyempää kuin 510nm, lähettää valoa pidempään kuin 510nm ja emissiovalon vastaanottoalue on 520-560nm.
Fluoresenssimikroskoopeissa yleisesti käytetyt fluoresenssisuodattimet voidaan jakaa kahteen tyyppiin: pitkäpäästö (lyhyesti LP) ja kaistanpäästö (lyhyesti BP). Kaistanpäästö määräytyy yleensä keskiaallonpituuden ja intervallin leveyden mukaan, kuten 480/40, mikä tarkoittaa, että valoa voidaan päästä läpi 460-500nm:stä. Pitkäpäästösuodattimet, kuten 515 LP, läpäisevät valoa, jonka aallonpituudet ovat yli 515 nm (kuva 5).
Fluoresoivilla aineilla on ominainen viritys (absorptio) käyrä ja emissiokäyrä, virityshuippu on ihanteellinen viritysaallonpituus (korkea viritysteho, joka voi vähentää viritysvalon energiaa, suojata soluja ja väriaineita), ja emissiokäyrä on emissiofluoresenssin aallonpituus. alue. Siksi kokeessa valitsemme viritykselle aallonpituuden, joka on mahdollisimman lähellä virityshuippua, ja vastaanottoalueen tulee sisältää emissiohuippu. Esimerkiksi Alexa Fluor 488:n virityshuippu on 500 nm, ja virityssuodatin 480/40 voidaan valita fluoresenssimikroskoopissa.
Suodatinkuutioiden tiedot ovat nähtävissä mikroskoopin kuvantamisohjelmistossa. Väriaineiden ymmärtäminen ja näytteesi parhaiten vastaavan suodattimen löytäminen on tärkeää fluoresenssikuvauksessa. Fluoresoivien väriaineiden ja fluoresoivien proteiinien spektritiedot on yleensä ilmoitettu ohjeissa, ja ne löytyvät myös verkosta.
Fluoresoivien koettimien viritys- ja emissioaallonpituuksien lisäksi suodatinlohkojen valinnassa on myös otettava huomioon, onko olemassa epäspesifistä viritystä ja onko monivärimerkityille näytteille ristiväriä. Lisäksi on otettava huomioon käytetty loisteputkivalon lähde. Tällä hetkellä yleisesti käytettyjä loistelamppuja ovat viime vuosina nopeasti kehittyneet elohopealamput, metallihalogenidilamput ja LED-valonlähteet. Fluoresoivan valonlähteen spektri on jatkuva tai epäjatkuva, ja energia on erilainen eri aallonpituuskaistoilla. LED-valonlähteestä on vähitellen tulossa fluoresenssimikroskoopin tärkein valonlähde suhteellisen kapea spektrikaistan, vakaamman energiantuotannon, pitkän käyttöiän, turvallisemman ja ympäristönsuojelun sekä monien muiden etujen ansiosta.
Mikroskoopissa on sisäänrakennetun suodatinlohkon lisäksi myös ulkoinen pikapyörä (kuva 7). Leican ulkoisen nopean pyörän vieressä olevan suodattimen muunnosnopeus on 27 ms, jolla voidaan toteuttaa nopeita monivärikokeita, kuten FRET- ja Fura2-suhteen kalsiumkuvausta. (Kuva 8) et ai.
Laaja valikoima fluoresenssimikroskopiakuvaustekniikoita
Erilaisia fluoresenssikuvaustarpeita varten on fluoresenssimikroskooppien lisäksi kehitetty erilaisia fluoresenssimikroskooppikuvausratkaisuja:
Laajakentän teräväpiirtokuvausjärjestelmät, kuten Leica THUNDER Imager, käyttävät Leican innovatiivista Clearing-tekniikkaa poistamaan tehokkaasti ei-fokusoiva tasohäiriösignaaleja kuvantamisen aikana, esittäen selkeitä kuvia ja suuren nopeuden kuvantamisen edut.
Konfokaalinen laserpyyhkäisymikroskooppi käyttää neulanreikiä eliminoimaan ei-fokusoiva tasohäiriö, toteuttaa optisen leikkaamisen ja saa teräväpiirtokuvia ja kolmiulotteisia kuvia;
Ultrakorkean resoluution mikroskoopit ja nanomikroskoopit, jotka rikkovat diffraktiorajan, voivat havaita hienoja rakenteita, jotka ovat pienempiä kuin 200 nm;
Monifotonikuvausjärjestelmä, joka käyttää monifotonivirityksen periaatetta paksun kudoksen ja syvän in vivo kuvantamiseen;
Kevytlevykuvaustekniikka, jolla on korkea ajallinen ja spatiaalinen resoluutio, nopea kuvantamisnopeus, korkea resoluutio, alhainen fototoksisuus, sopii erityisen hyvin kehitystutkimukseen ja in vivo -dynaamiseen havainnointiin;
Fluoresenssin elinikäinen kuvantaminen (FLIM), johon eivät vaikuta sellaiset tekijät kuin fluoresoivan aineen pitoisuus, valovalkaisu, viritysvalon intensiteetti jne., voi suorittaa syvempiä toiminnallisia ja tarkempia mittauksia.
Fluoresenssikorrelaatiospektroskopia (FCS) ja fluoresenssiristikorrelaatiospektroskopia (FCCS) mittaavat fluoresoivien molekyylien molekyylimäärää ja diffuusiokerrointa ja analysoivat siten molekyylipitoisuutta, molekyylikokoa, viskositeettia, molekyylien liikettä, molekyylien sitoutumista/dissosiaatiota ja ominaisuuksia;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), jonka z-akselin resoluutio on erittäin korkea, on ihanteellinen solukalvopintojen molekyylirakenteen ja dynamiikan tutkimiseen.
