Mikroskoopin luokittelu ja toimintaperiaate solututkimuksessa
Mikroskooppi on tärkein työkalu solujen tarkkailuun. Eri valonlähteiden mukaan se voidaan jakaa kahteen luokkaan: optiset mikroskoopit ja elektronimikroskoopit. Edellinen käyttää näkyvää valoa (UV-mikroskoopit käyttävät ultraviolettivaloa) valonlähteenä, kun taas jälkimmäinen käyttää elektronisäteitä valonlähteenä.
-,Optinen mikroskooppi
(1) Tavallinen optinen mikroskooppi
Tavalliset biologiset mikroskoopit koostuvat kolmesta osasta, nimittäin: ① valaistusjärjestelmä, mukaan lukien valonlähde ja lauhdutin; ② optinen suurennusjärjestelmä, joka koostuu objektiivilinssistä ja okulaarista, joka on mikroskoopin päärunko. Pallopoikkeaman ja kromaattisen poikkeaman poistamiseksi sekä okulaari että objektiivi ③Mekaaninen laite, jota käytetään materiaalin kiinnittämiseen ja havainnoinnin helpottamiseksi (kuva 2-1).
Se, onko mikroskoopin kuva selkeä, ei riipu pelkästään suurennuksesta, vaan myös mikroskoopin resoluutiosta. Tarkkuus viittaa mikroskoopin (tai ihmissilmän 25 cm:n etäisyydellä kohteesta) kykyyn erottaa pienin etäisyys kohteiden välillä. Resoluution koko määräytyy Valon aallonpituuden ja aukon suhde sekä väliaineen taitekerroin ilmaistaan kaavalla:
Kaavassa: n=väliaineen taitekerroin;=aukkokulma (näytteen avautumiskulma objektiivin linssin aukkoon), NA=linssin aukko (numeerinen aukko). Linssin kulma on aina alle 180 astetta, joten sina/2:n maksimiarvon on oltava pienempi kuin 1.
Optisen linssin valmistukseen käytetyn lasin taitekerroin on 1,65-1,78, ja käytetyn väliaineen taitekerroin on lähempänä lasia, sen parempi. Kuivien objektiivilinssien tapauksessa väliaine on ilma ja objektiivin aukkosuhde on yleensä 0.05 - 0,95; öljylinsseissä setriöljyä käytetään väliaineena ja linssin aukkosuhde voi olla lähellä 1,5.
Tavallisen valon aallonpituus on {{0}}nm, joten mikroskoopin resoluutioarvo ei ole pienempi kuin 0,2 μm ja ihmissilmän resoluutio on 0,2 mm, joten Yleisen mikroskoopin suurin suurennus on yleensä 1000X.
(2) Fluoresenssimikroskopia
Jotkut soluissa olevat aineet, kuten klorofylli, voivat fluoresoida ultraviolettisäteiden säteilytyksen jälkeen; jotkin aineet eivät itse pysty fluoresoimaan, mutta jos ne värjätään fluoresoivilla väriaineilla tai fluoresoivilla vasta-aineilla, ne voivat fluoresoida myös ultraviolettisäteillä, ja fluoresenssimikroskooppi (kuva 2-2, 3, 4) on yksi työkaluista. tällaisten aineiden laadulliseen ja kvantitatiiviseen tutkimukseen.
Fluoresenssimikroskoopeilla ja tavallisilla mikroskoopeilla on seuraavat erot:
1. Valaistusmenetelmä on yleensä epi-illuminaatio, eli valonlähde heijastetaan näytteeseen objektiivin läpi (kuva 2-3);
2. Valonlähde on ultraviolettivalo, aallonpituus on lyhyempi ja resoluutio suurempi kuin tavallisten mikroskooppien;
3. On olemassa kaksi erikoissuodatinta, valonlähteen edessä olevaa käytetään suodattamaan näkyvää valoa ja okulaarin ja objektiivin välissä olevaa ultraviolettivaloa suodattamaan silmien suojaamiseksi.
(3) Laserpyyhkäisykonfokaalinen mikroskooppi
Konfokaalinen laserpyyhkäisymikroskooppi (laserkonfokaalinen pyyhkäisymikroskooppi, kuva 2-5, 6) käyttää laseria skannaavana valonlähteenä ja skannaa kuvantamisen pisteeltä, viivalta, pinta pinnalta, ja skannaava laser- ja fluoresenssikokoelma jakaa objektiivilinssi, ja objektiivilinssin fokus on Pyyhkäisevän laserin polttopiste on myös hetkellisen kuvantamisen kohdepiste. Koska lasersäteen aallonpituus on lyhyt ja säde erittäin ohut, konfokaalisen laserpyyhkäisymikroskoopin resoluutio on korkeampi, mikä on noin 3 kertaa tavallista optista mikroskooppia. Järjestelmä tarkennetaan kerran ja skannaus rajoitetaan näytteen yhteen tasoon. Kun tarkennussyvyys on erilainen, näytteestä voidaan saada kuvia eri syvyystasoista. Nämä kuvatiedot tallennetaan tietokoneeseen. Tietokoneanalyysin ja simuloinnin avulla voidaan näyttää solunäytteen kolmiulotteinen rakenne.
Konfokaalista laserpyyhkäisymikroskopiaa voidaan käyttää paitsi solumorfologian tarkkailuun, myös solunsisäisten biokemiallisten komponenttien kvantitatiiviseen analyysiin, optisen tiheyden tilastoihin ja solumorfologian mittaamiseen.
(4) Pimeäkenttämikroskooppi
Tumman kentän mikroskoopissa (tumma kenttämikroskooppi, kuva 2-7) on valolevy kondensaattorin keskellä, joten valaistusvalo ei pääse suoraan ihmislinssiin, vaan vain näytteen heijastama ja taittuva valo saa päästä objektiiviin, joten näkökentän tausta on musta, Kohteiden reunat ovat kirkkaita. Tällä mikroskoopilla voidaan nähdä niinkin pieniä hiukkasia kuin 4-200nm, ja resoluutio voi olla 50 kertaa suurempi kuin tavallisten mikroskooppien.
(5) Vaihekontrastimikroskooppi
P. Zerniken vaihekontrastimikroskooppi (vaihekontrastimikroskooppi, kuva 2-8, 9) keksittiin vuonna 1932 ja voitti siitä Nobelin fysiikan palkinnon vuonna 1953. Tämän mikroskoopin suurin ominaisuus on, että se pystyy tarkkailemaan värjäytymättömiä näytteitä ja eläviä soluja.
Faasikontrastimikroskopian perusperiaate on muuttaa näytteen läpi kulkevan näkyvän valon optisen polun ero amplitudieroksi, jolloin eri rakenteiden välinen kontrasti paranee ja eri rakenteet näkyvät selvästi. Kun valo on kulkenut näytteen läpi, se taittuu, poikkeaa alkuperäisestä optisesta reitistä ja viivästyy 1/4λ:lla (aallonpituus). Vahvista, lisää tai vähennä amplitudia, lisää kontrastia. Rakenteeltaan faasikontrastimikroskoopeilla on kaksi erikoisominaisuutta, jotka eroavat tavallisista optisista mikroskoopeista:
1. Rengasmainen kalvo sijaitsee valonlähteen ja lauhduttimen välissä, ja sen tehtävänä on saada lauhduttimen läpi kulkeva valo muodostamaan onton valokartion ja keskittymään näytteeseen.
2. Vaihelevy (rengasmainen vaihelevy) lisää objektiivin linssiin magnesiumfluoridilla päällystetyn vaihelevyn, joka voi viivästyttää suoran valon tai taittuneen valon vaihetta 1/4λ:lla. Niitä on kahta tyyppiä:
①A plus vaihelevy: Suora valo viivästyy 1/4λ. Kun kaksi valoaaltoryhmää on yhdistetty, valoaallot lasketaan yhteen ja amplitudia kasvatetaan. Näytteen rakenne on kirkkaampi kuin ympäröivä väliaine, mikä muodostaa kirkkaan kontrastin (tai negatiivisen kontrastin).
② B plus vaihelevy: Taipunut valo viivästyy 1/4λ. Kun kaksi sädesarjaa on yhdistetty, valoaallot vähennetään ja amplitudi pienenee muodostaen tumman kontrastin (tai positiivisen kontrastin), ja rakenne on tummempi kuin ympäröivä väliaine.
(6) Polarisoiva mikroskooppi
Polarisoivaa mikroskooppia käytetään kahtaistaitteisten aineiden, kuten filamenttien, karojen, kollageenin, kromosomien ja niin edelleen havaitsemiseen. Erona tavallisiin mikroskoopeihin on se, että valonlähteen edessä on polarisaattori (polarisaattori), jolloin mikroskooppiin tuleva valo on polarisoitua valoa, ja siinä on analysaattori (polarisaattori, jonka polarisaatiosuunta on kohtisuorassa polarisaattoriin nähden). objektiivin piippu. Tämän mikroskoopin tasoa voidaan kiertää. Kun yksitaittava aine asetetaan lavalle, riippumatta siitä, miten lavaa pyöritetään, koska kaksi polarisaattoria ovat pystysuorassa, valoa ei näy mikroskoopissa eikä valoa näy mikroskoopissa. Kun kahtaistaittaviin materiaaleihin menee sisään, pyörivä vaihe voi havaita tällaiset esineet, koska valo poikkeaa kulkiessaan tällaisten materiaalien läpi.
