Optisen mikroskoopin fluoresenssihavainto
Fluoresenssi viittaa prosessiin, jossa fluoresoiva aine säteilee pidemmän aallonpituuden valoa lähes samanaikaisesti, kun sitä säteilytetään tietyn aallonpituuden omaavalla valolla (kuva 1). Kun tietyn aallonpituuden (viritysaallonpituuden) valo osuu molekyyliin, kuten fluoroforiin, fotonienergia absorboituu molekyylin elektroneihin. Seuraavaksi elektronit siirtyvät perustilasta (S0) korkeammalle energiatasolle, viritettyyn tilaan (S1'). Tätä prosessia kutsutaan viritykseksi①. Elektroni pysyy viritetyssä tilassa 10-9–10-8 sekuntia, jonka aikana elektroni menettää jonkin verran energiaa②. Prosessin aikana, jossa elektronit poistuvat viritetystä tilasta (S1) ja palaavat perustilaan③, vapautuu jäljellä oleva viritysprosessin aikana absorboitunut energia.
Fluoresoiva Jablonskin kaavio
Fluoresoivan molekyylin viipymäaika viritetyssä tilassa on fluoresenssin elinikä, joka on yleensä nanosekunnin tasolla ja on itse fluoresoivan molekyylin ominaisuus. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), joka käyttää fluoresenssin eliniän kuvantamistekniikkaa, voi suorittaa syvällisempiä toiminnallisia mittauksia fluoresenssin intensiteetin kuvantamisen lisäksi ja saada molekyylien konformaatiota, molekyylien välisiä vuorovaikutuksia ja molekyylien mikroympäristöä jne. Vaikeasti selvitettävää tietoa saada perinteisellä optisella kuvantamisella.
Toinen tärkeä fluoresenssin ominaisuus on Stokes-siirtymä, viritys- ja emissiohuippujen välinen aallonpituusero (kuva 2). Tyypillisesti emissioaallonpituus on pidempi kuin viritysaallonpituus. Tämä johtuu siitä, että elektronit menettävät osan energiastaan rentoutumisprosessin aikana sen jälkeen, kun fluoresoiva aine on viritetty ja ennen fotonien vapauttamista. Fluoresoivia aineita, joilla on suurempi Stokes-siirtymä, on helpompi havaita fluoresenssimikroskoopilla.
fluoresenssimikroskooppi
Fluoresenssimikroskooppi on optinen mikroskooppi, joka käyttää fluoresenssiominaisuuksia havainnointiin ja kuvantamiseen, ja sitä käytetään laajalti eri aloilla, kuten solubiologia, neurobiologia, kasvitiede, mikrobiologia, patologia ja genetiikka. Fluoresenssikuvauksen etuna on korkea herkkyys ja korkea spesifisyys, ja se soveltuu erittäin hyvin tiettyjen proteiinien ja organellien jakautumisen tarkkailuun kudoksissa ja soluissa, kolokalisaation ja vuorovaikutuksen tutkimukseen, elämän dynaamisten prosessien, kuten ionipitoisuuden muutosten, seurantaan. , jne.
Useimmat solujen molekyylit eivät fluoresoi, ja jos haluat nähdä ne, merkitse ne fluoresoivasti. Fluoresoivaa leimaamista varten on monia menetelmiä, kuten suora leimaus (kuten DAPI:n käyttö DNA:n leimaamiseen) tai immunovärjäys vasta-aineiden antigeeniä sitovia ominaisuuksia käyttäen tai fluoresoivien proteiinien (kuten GFP, vihreä fluoresoiva proteiini) käyttö kohdeproteiinien leimaamiseen. , ja käännettävä sidonta. synteettiset väriaineet (kuten Fura-2) jne.
Käänteinen fluoresenssimikroskooppi MF53-N
Tällä hetkellä fluoresenssimikroskoopista on tullut eri laboratorioiden ja kuvantamisalustojen vakiokuvauslaitteisto, ja se on hyvä apu päivittäisissä kokeissamme. Fluoresenssimikroskoopit jaetaan pääasiassa kolmeen luokkaan: pystyfluoresenssimikroskoopit (sopii leikkaamiseen), käänteisfluoresenssimikroskoopit (sopii eläville soluille leikkaus huomioon ottaen), fluoresoivat stereoskoopit (sopii suuremmille näytteille, kuten kasveille, seeprakalalle (aikuinen/alkio). ), medaka, hiiren/rotan elimet jne.).
Fluoresenssimikroskopiakuvaustekniikka on laajalti käytetty ja runsaasti tyyppejä, ja uusia tekniikoita on edelleen syntymässä. Voit valita tekniikan oman tutkimuksen suorittamiseksi.
