Fluoresenssimikroskooppien ja tavanomaisten optisten mikroskooppien vertailu ja ominaisuudet
Fluoresenssimikroskooppi eroaa tavallisesta optisesta mikroskoopista. Sen sijaan, että se tarkkailee näytteitä tavanomaisesta valonlähteestä valaistuna, se käyttää tietyn aallonpituuden valoa (yleensä ultraviolettivaloa tai siniviolettia valoa) fluoresoivien aineiden virittämiseen näytteessä, jolloin ne emittoivat fluoresenssia. Siksi fluoresenssimikroskoopin valonlähde ei toimi suorana valaistuksena; se toimii energialähteenä virittämään endogeenisiä fluoresoivia aineita näytteessä. Pystymme havainnoimaan näytettä ei lähteestä tulevan valaistuksen vuoksi, vaan näytteessä olevien fluoresoivien aineiden lähettämän fluoresenssin vuoksi herätevalon absorboimisen jälkeen.
Tästä seuraa, että fluoresenssimikroskoopin avainominaisuus on sen valonlähde, joka voi tuottaa runsaasti viritysvaloa tietyllä aallonpituusalueella riittävän viritysintensiteetin aikaansaamiseksi testinäytteessä oleville fluoresoiville aineille. Sillä välin fluoresenssimikroskooppi on varustettava vastaavalla suodatinjärjestelmällä. Fluoresenssihistokemian olennaisena työkaluna se koostuu pääasiassa ultrakorkeapaineisesta valonlähteestä, suodatinsarjasta (mukaan lukien virityssuodattimet ja sulkusuodattimet), optisesta järjestelmästä ja valokuvausjärjestelmästä. Se toimii jännittämällä näytteitä tietyn aallonpituuden omaavalla valolla tuottaen fluoresenssia.
Fluoresenssiviritysmenetelmät: Luokiteltu aallonpituusalueen mukaan UV-viritykseen (ultraviolettivalomenetelmä) ja BV-viritykseen (siniviolettivalomenetelmä). UV-viritys käyttää viritykseen lähes ultraviolettivaloa, joka on lyhyempi kuin 400 nm. Näkyvää viritysvaloa ei ole mukana, joten havaittu fluoresenssi osoittaa väriaineen luontaisen fluoresenssin. Tämän ansiosta näytteen spesifinen fluoresenssi on helppo erottaa taustakudoksen autofluoresenssista.
BV-viritysmenetelmä: Viritys suoritetaan valolla, joka vaihtelee ultraviolettisäteilystä siniseen valoon, keskipisteenä 404 nm ja 434 nm. Koska sininen valo säteilyttää näytettä tässä menetelmässä, fluoresenssin havainnointijärjestelmän katkaisusuodattimen on estettävä sininen valo kokonaan ja samalla läpäistävä täysin vaadittu vihreä ja keltainen fluoresenssi. Tätä menetelmää sovelletaan fluorokromeihin, joita käytetään fluoresoivissa vasta-ainetekniikoissa. Viritysvalon maksimiabsorptioaallonpituus ja fluoresenssin maksimiemissioaallonpituus ovat suhteellisen lähellä, joten BV-viritykseen tarvitaan teräväleikkaussuodattimia. Sinistä valoa käytetään viritysvalona, mikä tuo fluorokromeille korkean absorptiotehokkuuden ja kirkkaampia kuvia. Sen haittapuoli on, että alle 500 nm:n fluoresenssia ei voida havaita, ja yli 500 nm:n signaalit antavat koko kuvalle keltaisen sävyn. Fluoresoivissa vasta-ainemäärityksissä spesifisyys arvioidaan enimmäkseen fluorokromin ominaisvärin perusteella. Siksi hienovaraista spesifisyyttä arvioitaessa edellä mainitulla BV-viritysmenetelmän haitalla voi olla merkittävä vaikutus.
