Kahden fotonin fluoresenssimikroskopialla on monia etuja:
1) Sironta vaikuttaa vähemmän valon pidempiin aallonpituuksiin kuin lyhyempiin valon aallonpituuksiin tunkeutumaan näytteeseen;
(2) Fluoresoivia molekyylejä polttotason ulkopuolella ei viritetä, jotta enemmän viritysvaloa pääsee polttotasolle, jotta viritysvalo voi tunkeutua syvemmälle näytteeseen;
3) Lähi-infrapunavalon pidemmät aallonpituudet ovat vähemmän myrkyllisiä soluille kuin lyhyemmät aallonpituudet;
4) Kun näytettä tarkkaillaan kaksifotonimikroskoopilla, valovalkaisua ja fototoksisuutta esiintyy vain polttotasolla. Siksi kaksifotonimikroskoopit sopivat paremmin kuin yksifotonimikroskoopit paksujen näytteiden tarkkailuun, elävien solujen tarkkailuun tai spot-valovalkaisukokeiden suorittamiseen.
Konfokaalifluoresenssimikroskoopin tuntemus
Konfokaalifluoresenssimikroskoopin perusperiaate: pistevalolähdettä käytetään näytteen säteilyttämiseen muodostaen pienen, tarkasti määritellyn valopisteen polttotasolle. Tästä pisteestä säteilytyksen jälkeen emittoitu fluoresenssi kerätään objektiivilinssillä ja lähetetään takaisin säteenjakajaan, joka koostuu kaksisuuntaisesta kromaattisesta peilistä alkuperäistä säteilytysvalopolkua pitkin. Säteenjakaja lähettää fluoresenssin suoraan ilmaisimeen. Sekä valonlähteen että ilmaisimen edessä on neulanreikä, joita kutsutaan vastaavasti valaistuksen neulanreikiksi ja ilmaisimen reikäksi. Molemmilla on sama geometria, noin 100-200 nm, ja ne ovat konjugoituneita polttotason valopisteen suhteen, eli valopiste kulkee linssisarjan läpi ja voidaan lopulta tarkentaa molempiin valaiseviin ja ilmaisimen neulanreiät. Tällä tavalla polttotasosta tuleva valo voi konvergoida anturin aukon sisällä, kun taas polttotason ylä- tai alapuolelta sironnut valo on estetty anturin aukon ulkopuolella, eikä sitä voida kuvata. Laser skannaa näytteen piste pisteeltä, ja valomonistinputki neulanreiän havaitsemisen jälkeen saa myös vastaavan valopisteen konfokaalisen kuvan piste pisteeltä, joka muunnetaan digitaaliseksi signaaliksi ja lähetetään tietokoneelle ja lopuksi konvergoi selkeäksi. konfokaalinen kuva koko polttotasosta näytöllä.
Jokainen polttotason kuva on itse asiassa näytteen optinen poikkileikkaus, ja tällä optisella poikkileikkauksella on aina tietty paksuus, joka tunnetaan myös optisena levynä. Koska valon intensiteetti polttopisteessä on paljon suurempi kuin ei-fokusoivassa pisteessä ja ei-fokusoiva tason valo suodatetaan neulanreiällä, konfokaalijärjestelmän terävyysalue on likimääräinen nolla, ja skannaus Z-akselin suunnassa mahdollistaa optisen tomografian muodostaa kaksiulotteisen optisen siivun näytteestä, jota voidaan tarkkailla polttopisteessä. Yhdistämällä XY-tason (fokusointitaso) skannauksen Z-akselin (optisen akselin) skannaukseen, näytteestä voidaan saada kolmiulotteinen kuva keräämällä peräkkäisiä kerroksia kaksiulotteisia kuvia, jotka käsitellään erikoistuneella tietokoneohjelmistolla.
Tämä tarkoittaa, että tunnistusneulanreikä ja valonlähteen neulanreikä on aina fokusoitu samaan pisteeseen, joten polttotason ulkopuolella viritetty fluoresenssi ei pääse tunnistusreikään.
Laserkonfokaalin toimintaperiaate ilmaistaan yksinkertaisesti siten, että se käyttää laseria valonlähteenä perinteisen fluoresenssimikroskoopin kuvantamisen, ylimääräisen laserskannauslaitteen ja konjugaattitarkennuslaitteen perusteella tietokoneohjauksella digitaalisen kuvan hankinta- ja käsittelyjärjestelmän suorittamiseksi.
