Fluoresenssimikroskoopin periaate ja rakenteelliset ominaisuudet
Fluoresenssimikroskopia käyttää pistettä, jolla on korkea valotehokkuus, lähettämään tietyn aallonpituuden valoa (kuten ultraviolettivaloa 3650 tuumaa tai violetinsinistä valoa 4200 tuumaa) värisuodatusjärjestelmän läpi viritysvalona ja virittää näytteessä olevat fluoresoivat aineet lähettämään erilaisia fluoresenssin värejä. Sen jälkeen sitä tarkkaillaan objektiivin ja okulaarin suurennuksella. Tällä tavalla se on helppo tunnistaa, vaikka fluoresenssi on erittäin heikko vahvaa taustaa vasten, korkealla herkkyydellä. Sitä käytetään pääasiassa solujen rakenteen ja toiminnan sekä kemiallisen koostumuksen tutkimiseen. Fluoresenssimikroskoopin perusrakenne koostuu tavallisesta optisesta mikroskoopista sekä lisälaitteista, kuten fluoresoivasta valonlähteestä, virityssuodattimesta, dikroisisen säteen erottimesta ja estosuodattimesta. Fluoresoivat valonlähteet käyttävät yleensä ultrakorkeapaineisia elohopealamppuja (50-200W), jotka voivat lähettää valoa eri aallonpituuksilla. Jokaisella fluoresoivalla aineella on kuitenkin viritysvalon aallonpituus, joka tuottaa voimakkaimman fluoresenssin, joten virityssuodattimia (tyypillisesti ultravioletti-, violetti-, sininen ja vihreä virityssuodattimet) on lisättävä, jotta vain tietyn aallonpituuden viritysvalo pääsee tunkeutumaan ja säteilyttämään näyte absorboi samalla kaiken muun valon. Viritysvalolla säteilytettyään jokainen aine emittoi näkyvää fluoresenssia kauemmin kuin säteilytyksen aallonpituus hyvin lyhyessä ajassa. Fluoresenssi on spesifistä ja yleensä heikompaa kuin viritysvalo. Tietyn fluoresenssin havaitsemiseksi on tarpeen lisätä objektiivin taakse esto (tai vaimennus) ja käyttää sitä yhdessä.
Ero fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen mikroskoopin välillä
1. Valaistusmenetelmä on yleensä putoava säde, jossa valonlähde heijastetaan näytteeseen objektiivin läpi;
2. Valonlähde on ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on lyhyempi ja resoluutio suurempi kuin tavallisilla mikroskoopeilla;
3. On olemassa kaksi erityistä suodatinta, valonlähteen edessä olevaa käytetään suodattamaan näkyvää valoa, ja okulaarin ja objektiivin välissä olevaa käytetään ultraviolettisäteiden suodattamiseen ihmissilmän suojaamiseksi.
Fluoresenssimikroskopia on myös eräänlainen optinen mikroskopia, jonka tärkein ero on erilaiset viritysaallonpituudet. Tämä määrittää erot rakenteessa ja käytössä fluoresoivan mikroskopian ja tavallisen optisen mikroskopian välillä.
Fluoresenssimikroskopia on immunofluoresenssisytokemian perustyökalu. Se koostuu pääkomponenteista, kuten valonlähteestä, suodatinlevyjärjestelmästä ja optisesta järjestelmästä. Se käyttää tiettyä valon aallonpituutta herättämään näytteen lähettämään fluoresenssia ja suurentaa sen objektiivilinssin ja okulaarijärjestelmän kautta tarkkaillakseen näytteen fluoresenssikuvaa.
