Optisen mikroskoopin tärkein havainnointimenetelmä on fluoresenssihavainto
Fluoresenssi viittaa prosessiin, jossa fluoresoiva aine säteilee pidemmän aallonpituuden valoa lähes samanaikaisesti, kun sitä säteilytetään tietyn aallonpituuden omaavalla valolla (kuva 1). Kun tietyn aallonpituuden (viritysaallonpituuden) valo osuu molekyyliin, kuten fluoroforiin, fotonienergia absorboituu molekyylin elektroneihin. Seuraavaksi elektronit siirtyvät perustilasta (S0) korkeammalle energiatasolle, viritettyyn tilaan (S1'). Tätä prosessia kutsutaan viritykseksi①. Elektroni pysyy viritetyssä tilassa 10-9–10-8 sekuntia, jonka aikana elektroni menettää jonkin verran energiaa②. Prosessin aikana, jossa elektronit poistuvat viritetystä tilasta (S1) ja palaavat perustilaan③, vapautuu jäljellä oleva viritysprosessin aikana absorboitunut energia.
Fluoresoivan molekyylin viipymäaika viritetyssä tilassa on fluoresenssin elinikä, joka on yleensä nanosekunnin tasolla ja on itse fluoresoivan molekyylin ominaisuus. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), joka käyttää fluoresenssin eliniän kuvantamistekniikkaa, on nimeltään fluorescence lifetime imaging (FLIM). Fluoresenssin intensiteetin kuvantamisen lisäksi voidaan saada syvempiä toiminnallisia ja tarkempia mittauksia molekyylien konformaation, molekyylien välisten vuorovaikutusten ja molekyylien mikroympäristön saamiseksi. Tietoa, jota on vaikea saada tavanomaisella optisella kuvantamisella.
Toinen tärkeä fluoresenssin ominaisuus on Stokes-siirtymä, viritys- ja emissiohuippujen välinen aallonpituusero (kuva 2). Tyypillisesti emissioaallonpituus on pidempi kuin viritysaallonpituus. Tämä johtuu siitä, että elektronit menettävät osan energiastaan rentoutumisprosessin aikana sen jälkeen, kun fluoresoiva aine on viritetty ja ennen fotonien vapauttamista. Fluoresoivia aineita, joilla on suurempi Stokes-siirtymä, on helpompi havaita fluoresenssimikroskoopilla.
Fluoresenssimikroskopia ja fluoresenssisuodatinkuutiot
Fluoresenssimikroskooppi on optinen mikroskooppi, joka käyttää fluoresenssiominaisuuksia havainnointiin ja kuvantamiseen, ja sitä käytetään laajalti eri aloilla, kuten solubiologia, neurobiologia, kasvitiede, mikrobiologia, patologia ja genetiikka. Fluoresenssikuvauksen etuna on korkea herkkyys ja korkea spesifisyys, ja se soveltuu erittäin hyvin tiettyjen proteiinien ja organellien jakautumisen tarkkailuun kudoksissa ja soluissa, kolokalisaation ja vuorovaikutuksen tutkimukseen, elämän dynaamisten prosessien, kuten ionipitoisuuden muutosten, seurantaan. , jne.
Useimmat solujen molekyylit eivät fluoresoi, ja niiden näkeminen edellyttää fluoresoivaa leimaa. Fluoresoivaa leimaamista varten on monia menetelmiä, kuten suora leimaus (kuten DAPI:n käyttö DNA:n leimaamiseen) tai immunovärjäys vasta-aineiden antigeeniä sitovia ominaisuuksia käyttäen tai fluoresoivien proteiinien (kuten GFP, vihreä fluoresoiva proteiini) käyttö kohdeproteiinien leimaamiseen. , ja käännettävä sidonta. Synteettiset väriaineet (kuten Fura-2) ja niin edelleen.
Tällä hetkellä fluoresenssimikroskoopista on tullut eri laboratorioiden ja kuvantamisalustojen vakiokuvauslaitteisto, ja se on hyvä apu päivittäisissä kokeissamme. Fluoresenssimikroskoopit jaetaan pääasiassa kolmeen luokkaan: pystyfluoresenssimikroskoopit (sopii viipalointiin), käänteiset fluoresenssimikroskoopit (sopii eläville soluille, ottaen huomioon viipalointi), fluoresenssistereoskoopit (sopii suuremmille näytteille, kuten kasveille, seeprakalalle (aikuinen/alkio). ), medaka, hiiren/rotan elimet jne.).
Fluoresenssisuodatinlohko on mikroskoopin fluoresenssikuvauksen ydinkomponentti. Se koostuu kolmesta osasta: virityssuodatin, emissiosuodatin ja dikroinen säteen jakaja. Se on asennettu suodatinpyörään. Esimerkiksi Leica DMi8 on varustettu 6-asentosuodatinpyörällä (kuva 3). Eri mikroskoopin pyörien asentojen määrä on erilainen, ja jotkin mikroskoopit käyttävät suodatinlevyjä.
Suodatinlohkolla on tärkeä rooli fluoresenssikuvauksessa: virityssuodatin valitsee viritysvalon näytteen virittämistä varten ja estää muiden aallonpituuksien valon; virityssuodattimen läpi kulkeva valo kulkee dikroisen peilin läpi (sen tehtävänä on heijastaa viritysvaloa ja välittää fluoresenssia), Heijastuksen jälkeen objektiivi fokusoi sen, säteilyttää näytteen ja virittää vastaavan fluoresenssin, ts. , säteilee valoa. Objektiivin linssi kerää säteilevän valon, kulkee dikroisen säteen jakajan läpi ja saavuttaa emissiosuodattimen. Kuten kuvassa 4: virityksen aallonpituus on 450-490nm, dikroinen peili heijastaa valoa, joka on lyhyempi kuin 510 nm, lähettää valoa, joka on pidempi kuin 510 nm, ja emittoidun valon vastaanottoalue on 520-560 nm.
