Ero (kaksifotonin, konfokaalisen) fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen mikroskoopin välillä
Kaksifotoni herätyksen perusperiaate on, että korkean fotonitiheydellä fluoresoivat molekyylit voivat samanaikaisesti absorboida kaksi pitkää aallonpituusfotonia ja lähettää lyhyemmän aallonpituusfotonin lyhyen ns. Veristyneiden tilaajan ajan; Vaikutus on sama kuin käyttämällä fotonia, jolla on puolet pitkän aallonpituuden aallonpituudesta fluoresoivien molekyylien herättämiseksi. Kaksi fotoniveroitusta vaatii korkean fotonitiheyden, ja solujen vahingoittamisen välttämiseksi kaksifotonimikroskopia käyttää korkean energian moodin lukittuja pulssilasereita. Tämän laserin lähettämällä laserilla on korkea huippuenergia ja alhainen keskimääräinen energia, pulssin leveys on vain 100 femtosekuntia ja taajuus enintään 80 - 100 megahertsia. Kun käytetään korkeaa numeerista aukko-objektiivilinssiä pulssitetun laserin fotonien keskittymiseen, fotonitiheys objektiivisen linssin polttopisteessä on korkein ja kaksifotoni viritys tapahtuu vain objektiivilinssin keskipisteessä. Siksi kaksifotonimikroskooppi ei vaadi konfokaalista reikää, mikä parantaa fluoresenssin havaitsemisen tehokkuutta.
Yleensä fluoresenssiilmiöt johtuen viritysvalon alhaisesta fotonitiheydestä fluoresoiva molekyyli voi absorboida vain yhden fotonin kerrallaan ja lähettää sitten toisen fluoresoivan fotonin säteilysiirtymän kautta, joka tunnetaan yksinäisen fotonin fluoresenssina. Fluoresenssivirheprosesseissa, joissa käytetään lasereita valonlähteinä, voi esiintyä kaksifotonia tai jopa monifotonin fluoresenssi-ilmiöitä. Tässä tapauksessa käytetyllä viritysvalonlähteellä on korkea intensiteetti ja fotonitiheys, joka täyttää fluoresoivien molekyylien vaatimuksen kaksi fotonia samanaikaisesti. Prosessissa, jota käytetään yleistä laseria viritysvalonlähteenä, fotonitiheys on edelleen riittämätön tuottamaan kaksifotonin absorptioilmiö. Tyypillisesti käytetään femtosekunnin pulssilasereita, ja välitöntä voimaa saavuttaa megawattitason. Siksi kaksifotonin fluoresenssin aallonpituus on lyhyempi kuin viritysvalon, mikä vastaa puoliksi virityksen aallonpituuden herättämisellä tuotettua vaikutusta.
Konfokaaliseen fluoresenssimikroskopiaan liittyvä tieto
Konfokaalisen fluoresenssimikroskopian perusperiaate on käyttää pisteen valonlähdettä näytteen säteilyttämiseen, muodostaen hyvin määritellyn pienen valon pisteen polttotasolle. Tästä pisteestä säteilytyksen jälkeen säteilytyksen jälkeen objektiivilinssillä on fluoresenssi ja lähetetään takaisin alkuperäistä säteilypolkua pitkin dikroisesta peilistä koostuvaan säteenjakoon. Spektrometri lähettää fluoresenssin suoraan ilmaisimelle. Sekä valonlähteen että ilmaisimen edessä on reikä, jota kutsutaan vastaavasti valaistusnappareiäksi ja ilmaisun reikiksi. Näiden kahden geometriset mitat ovat yhdenmukaisia, suunnilleen 100-200 nm; Verrattuna polttotason valopisteeseen, nämä kaksi ovat konjugaatteja, mikä tarkoittaa, että valopiste kulkee linssisarjan läpi ja voi viime kädessä keskittyä sekä valaistusnanreiään että havaitsemisneiän reikään samanaikaisesti. Tällä tavoin polttotasolta voi lähentyä havaitsemisreiän alueella, kun taas hajallaan oleva valo polttoaineen ylä- tai alapuolelta on estetty havaitsemisreiän ulkopuolelle eikä sitä voida kuvata. Skannaamalla näytepiste pistettä laserilla, pinreiän havaitsemisen jälkeen oleva valomultiplier -putki saa myös vastaavan valonpistepisteen konfokaalisen kuvan pisteestä, muuntaa sen digitaaliseksi signaaliksi ja lähettää sen tietokoneelle ja lopulta yhdistää sen selkeään konfokaaliseen kuvaan koko polttokoneen näytölle.
