Kaksifotonifluoresenssimikroskoopin tekniset ominaisuudet ja käyttötaidot
Kahden fotonin fluoresenssimikroskopia on uusi tekniikka, jossa yhdistyvät laserpyyhkäisykonfokaalimikroskopia ja kahden fotonin viritystekniikka.
Kaksifotonivirityksen perusperiaate on: korkean fotonitiheyden tapauksessa fluoresoivat molekyylit voivat absorboida kaksi pitkäaaltoista fotonia samanaikaisesti ja emittoi lyhyemmän ns. viritetyn tilan elinajan jälkeen lyhyemmän aallonpituisen fotonin. . ; Vaikutus on sama kuin käytettäessä fotonia, jonka aallonpituus on puolet pitkästä aallonpituudesta, fluoresoivan molekyylin virittämiseen. Kahden fotonin heräte vaatii korkean fotonitiheyden. Jotta solut eivät vahingoittuisi, kaksifotonimikroskoopissa käytetään korkean energian tilalukittuja pulssilasereita. Tämän laserin lähettämällä laserilla on korkea huippuenergia ja alhainen keskimääräinen energia, sen pulssin leveys on vain 100 femtosekuntia ja sen jakso voi olla 80-100 megahertsiä. Käytettäessä suuren numeerisen aukon objektiivilinssiä pulssilaserin fotonien tarkentamiseen, fotonitiheys objektiivilinssin polttopisteessä on suurin ja kahden fotonin viritys tapahtuu vain objektiivin polttopisteessä, joten kaksifotonimikroskooppi ei tarvitse konfokaalista neulanreikää, mikä parantaa fluoresenssitunnistuksen tehokkuutta. Se on tärkeä tutkimusmenetelmä morfologian, molekyylisolubiologian, neurotieteen ja farmakologian aloilla.
1. Kaksifotonimikroskoopin syntymisen tausta - perinteisen laserkonfokaalimikroskopian kaksi rajoitusta:
1) Yksi on fototoksisuusilmiö: koska konfokaalisen neulanreiän on oltava riittävän pieni korkearesoluutioisen kuvan saamiseksi ja pieni aukko estää suuren osan näytteestä emittoidusta fluoresenssista, mukaan lukien polttotasosta säteilevän fluoresenssin, vastaava Kyllä, viritysvalon on oltava riittävän voimakas riittävän signaali-kohinasuhteen saamiseksi; ja korkean intensiteetin laser saa fluoresoivan väriaineen haalistumaan nopeasti jatkuvan skannauksen aikana, ja fluoresoiva signaali heikkenee ja heikkenee skannauksen edetessä.
2) Fototoksisuus on toinen ongelma. Lasersäteilyssä monet fluoresoivat väriainemolekyylit tuottavat sytotoksiineja, kuten singlettihappea tai vapaita radikaaleja, joten skannausaikaa ja viritysvalon optista tehotiheyttä tulisi rajoittaa kokeessa näytteen tiheyden ylläpitämiseksi. aktiivinen. Aktiivinäytteiden tutkimuksessa, erityisesti aktiivisten näytteiden kasvun ja kehityksen eri vaiheet, valovalkaisu ja fototoksisuus tekevät näistä tutkimuksista hyvin rajallisia.
2. Miksi väität, että kaksifotonimikroskooppeja ei yleensä tarvitse varustaa ultraviolettivirityslasereilla?
Kaksifotonimikroskooppi on fluoresenssiviritystekniikka, joka perustuu kahden fotonin viritysefektiin: fluoresoivia väriainemolekyylejä voidaan virittää absorboimalla kahta matalaenergistä fotonia samanaikaisesti (aikaväli kahden fotonin saavuttaessa fluoresoivat molekyylit on alle 1 femtosekunti ), sen viritysvaikutus voi olla yhtä suuri kuin 1/2 aallonpituuden suuren energian fotonin absorbointi. Esimerkiksi kahden fotonin absorboiminen punaisilla aallonpituuksilla vastaa ultraviolettisäteilyä absorboivaa molekyyliä. Solut eivät absorboi helposti pitkän aallonpituisia fotoneja, joten valotoksisuus eläville soluille vähenee ja myös valovalkaisu vähenee. Tällä tavalla se ei ainoastaan toimi ultraviolettivirityksenä, vaan myös välttää ultraviolettivalon vahingoittumisen näytteeseen.
3. Mitä erikoista on kaksifotonimikroskoopin laserissa?
Kahden fotonin absorption todennäköisyys riippuu siitä, kuinka lähellä kaksi osuvaa fotonia ovat avaruudessa ja ajassa yhteneväisiä (kahden fotonin tulee saapua 10-18 sekunnissa). Kahden fotonin absorptiopoikkileikkaus on pieni, ja vain fluoroforit alueilla, joilla on suuri fotonivirta, viritetään. Siksi suurin osa käytetyistä lasereista on titaanisafiirilasereita, joilla voidaan saavuttaa piko- tai femtosekunnin skannausnopeuksia ja joilla on erittäin korkea huipputeho ja alhainen keskimääräinen teho, joten valovalkaisua ja fototoksisuutta voidaan vähentää tai poistaa. Tärkeintä on tarjota erittäin korkea fotonitiheys pienellä alueella, joka voi varmistaa kahden fotonin samanaikaisen virityksen.
4. Mitkä ovat kaksifotoniviritteen edut?
1) Lisää väriaineen selektiivisyyttä: konfokaalijärjestelmän laserin (Ar, Ar/Kr, HeNe) viritysvaloalue on 488nm - 647nm. Tämä tarkoittaa kokeilua UV-virittyneillä fluoresoivilla väriaineilla, esim. DAPI:lla, Hoeschtilla. Kahden fotonin viritysaallonpituus on kaksi kertaa yhden fotonin viritysaallonpituus, joten ultraviolettisäteilyllä virittyneet värit voidaan virittää lähi-infrapunavalolla.
2) Vähennä valovalkaisua: Koska valovalkaisu on vähentynyt, CFP/YFP:tä fluoresenssiresonanssienergian siirtoon (FRET) käyttävien kokeiden onnistumisprosentti kasvaa.
3) Erityistä objektiivilinssiä ei tarvita: Laitteiston näkökulmasta UV-viritettyjen väriaineiden viritys lähi-infrapunavalon aallonpituudella ei vaadi erityisiä UV-optisia komponentteja.
4) Paranna signaali-kohinasuhdetta: viritysvalon aallonpituudella ja emittoidun valon aallonpituudella on suuri ero, mikä parantaa signaali-kohinasuhdetta.
5) Polttopisteeseen paikallinen valkaisu: Koska fluoresenssiviritys tapahtuu vain objektiivin polttopisteessä, konfokaalista neulanreikää ei tarvita. Tämä parantaa valon havaitsemista ja valovalkaisua tapahtuu vain polttopisteessä.
6) Helposti tunkeutuvat näytteet: Infrapuna-aallonpituusvalo ei hajoa helposti soluista, ja se voi tunkeutua syvemmille näytteille.
5. Mikä on kaksifotonimikroskoopin suurin parannus verrattuna laserpyyhkäisykonfokaalimikroskopiaan?
1) Vähentynyt valovalkaisu.
2) Vähentynyt fototoksisuus.
3) Sitä ei ole helppo sirottaa, ja paksuihin näytteisiin, kuten aivoviipaleisiin, on helpompi tunkeutua.
