Fluoresenssimikroskoopin periaatteet
Fluoresenssimikroskoopit eroavat tavallisista optisista mikroskoopeista. Sen sijaan, että havainnoisivat näytteitä tavallisten valonlähteiden valaistuksessa, ne käyttävät tietyn aallonpituuden valoa (yleensä ultraviolettivaloa, siniviolettia valoa) mikroskoopin alla olevien näytteiden fluoresoivien aineiden virittämiseksi saadakseen ne säteilemään fluoresenssia. Siksi fluoresenssimikroskoopin valonlähde ei toimi suorana valaistuksena, vaan energialähteenä, joka virittää näytteen sisällä olevia fluoresoivia aineita. Syy, miksi voimme tarkkailla näytettä, johtuu valonlähteen valaistuksesta, mutta fluoresenssiilmiö, joka ilmenee sen jälkeen, kun näytteessä oleva fluoresoiva aine absorboi virittyneen valoenergian.
Voidaan nähdä, että fluoresenssimikroskoopin ominaisuus on, että sen valonlähde pystyy tuottamaan suuren määrän viritysvaloa tietyllä aallonpituusalueella, jolloin testattavassa näytteessä oleva fluoresoiva aine voi saada tarvittavan intensiteetin viritysvaloa. Samalla fluoresenssimikroskoopissa on oltava vastaava suodatinjärjestelmä.
Fluoresenssimikroskopia on tärkeä työkalu immunofluoresenssihistokemiassa. Se koostuu ultrakorkeajännitteisestä valonlähteestä, suodatinjärjestelmästä (mukaan lukien viritys- ja vaimennussuodatinlevy), optisesta järjestelmästä ja valokuvausjärjestelmästä sekä muista pääkomponenteista. Se käyttää tietyn aallonpituuden valoa herättämään näytteen lähettämään fluoresenssia.
Tapa herättää fluoresenssi: Valon aallonpituusalueen mukaan se voidaan jakaa kahteen tyyppiin: UV-viritysmenetelmä (käyttämällä ultraviolettivalomenetelmää) ja BV-viritysmenetelmä (käyttäen siniviolettia valoa). UV-viritysmenetelmässä käytetään viritykseen alle 400 nm lyhyttä ultraviolettivaloa. Tässä menetelmässä ei ole näkyvää viritysvaloa, joten havaittu fluoresenssi edustaa väriaineen luontaista fluoresenssia, ja näytteen spesifinen fluoresenssi on helppo erottaa taustakudoksen autofluoresenssista.
BV-viritysmenetelmä perustuu 404 nm:iin ja 434 nm:iin virityksessä ultraviolettivalosta siniseen valoon. Tämä menetelmä käyttää sinistä valoa näytteen säteilyttämiseen, joten fluoresenssihavaintojärjestelmän rajasuodattimen on käytettävä suodatinta, joka voi estää sinisen valon kokonaan ja läpäistä vaaditun vihreän ja keltaisen fluoresenssin. Fluoresoivat väriaineet fluoresoiviin vasta-ainemäärityksiin. Viritysvalon maksimiabsorptioaallonpituus on suhteellisen lähellä fluoresenssin maksimiemissioaallonpituutta, joten BV-viritysmenetelmässä käytettävän suodattimen tulee käyttää terävää katkaisusuodatinta. Tämä menetelmä voi käyttää sinistä valoa viritysvalona, jolloin fluoresoivan pigmentin absorptiotehokkuus on korkeampi ja saadaan kirkkaampi kuva. Sen haittapuoli on, että fluoresenssia alle 500 nm ei voida nähdä, ja fluoresenssi yli 500 nm saa koko kuvan näyttämään keltaiselta. Fluoresoivassa vasta-ainemenetelmässä fluorokromin spesifisyys arvioidaan usein fluorokromille ominaisen värin perusteella. Siksi, kun puhutaan hienovaraisesta spesifisyydestä, yllä mainituilla BV-herätysmenetelmän puutteilla on usein suuri vaikutus.
Yhteenvetona voidaan todeta, että fluoresenssimikroskoopin valaistusta voidaan tarkastella seuraavien kolmen kohdan mukaisesti kondensaattorin rakenteen ja viritysvalon aallonpituuden mukaan.
① Fluoresoivan kuvan kontrastivaatimusten näkökulmasta valaistukseen käytetään UV-virityksen tummakenttäkeskittäjää.
② Kun otetaan huomioon kuvan kirkkaus, BV-virityssuodattimella on korkein pimeän kentän havaintotehokkuus.
③ UV-virityssuodattimen pimeän kentän havainnoinnin ja BV-virityspimeän kentän keskittimen valaistuksen ominaisuudet voidaan katsoa näiden kahden valaistustavan väliin, mutta ensimmäisellä on vahvemmat tummakentän ominaisuudet ja se näyttää kirkkaampia kuvia. Kontrasti on pieni; jälkimmäinen säilyttää tumman kentän valopolun ominaisuudet, joten näytettävä kuva on tummempi ja kontrasti paranee. Kun itse asiassa käytetään fluoresenssimikroskooppia, havainnointiin tulee käyttää näytteen vaatimuksiin parhaiten sopivaa valaistusmenetelmää.
On huomioitava, että vaikka UV-viritetty tummakenttäkondensaattori, jolla on paras kontrasti, olisi valaistu, osa näytteen taittamasta tai sirottamasta ultraviolettiviritysvalosta pääsee objektiiviin. Autofluoresenssi voi huonontaa kuvavastetta. Siksi okulaarin edessä on käytettävä UV-säteilyä absorboivaa suodatinta katkaisusuodattimena.
