Fluoresenssimikroskooppien periaate ja rakenneominaisuudet
Fluoresoiva valonlähde käyttää yleensä ultrakorkeapaineista elohopealamppua (50–200 W), joka lähettää valoa eri aallonpituuksilla. Jokaisella fluoresoivalla aineella on kuitenkin erityinen viritysaallonpituus, joka tuottaa voimakasta fluoresenssia. Tästä syystä tarvitaan virityssuodatin (saatavana tavallisesti ultravioletti-, violetti-, sininen ja vihreä tyypeissä), jotta vain tietyn aallonpituuden omaava viritysvalo päästää näytteen läpi ja säteilyttää samalla kaikki muut aallonpituudet.
Viritysvalolla säteilytettynä jokainen aine emittoi näkyvää fluoresenssia pidemmällä aallonpituudella kuin viritysvalo erittäin lyhyessä ajassa. Fluoresenssi on erittäin spesifistä ja yleensä heikompaa kuin viritysvalo. Tämän erityisen fluoresenssin havaitsemiseksi objektiivin taakse on asennettava esto- (tai vaimennus-) suodatin. Sillä on kaksi tarkoitusta: ensinnäkin se absorboi ja estää viritysvaloa pääsemästä okulaarin sisään, jotta vältetään häiritseminen fluoresenssihavainnointiin ja silmien vaurioituminen; toiseksi se välittää valikoivasti spesifistä fluoresenssia tuottaakseen selkeän fluoresoivan värin. Nämä kaksi suodatintyyppiä on valittava ja niitä on käytettävä yhteensopivina pareina.
Fluoresenssimikroskoopit jaetaan kahteen tyyppiin niiden optisen polun perusteella:
1. Läpäisevän valon fluoresenssimikroskooppi
Tässä mallissa viritysvalon lähde kulkee lauhduttimen ja näytemateriaalin läpi virittäen fluoresenssia. Tumman kentän lauhdutinta käytetään yleisesti, mutta myös tavallista lauhdutinta voidaan käyttää; heijastava peili on säädetty ohjaamaan uudelleen ja sivulta säteilyttämään viritysvalo näytteeseen. Tämä on suhteellisen vanhempi tyyppinen fluoresenssimikroskooppi. Sen etuna on voimakas fluoresenssi pienellä suurennuksella, kun taas sen haittana on, että fluoresenssin intensiteetti pienenee suurennuksen kasvaessa. Siksi se soveltuu paremmin suurempien näytemateriaalien tarkkailuun.
2. Epifluoresenssimikroskooppi
Tämä on moderni, hiljattain kehitetty fluoresenssimikroskooppi. Toisin kuin läpäisevän valon suunnittelussa, viritysvalo projisoidaan alaspäin objektiivin läpi näytteen pinnalle - sama objektiivilinssi toimii sekä valaistuksen kondensaattorina että fluoresenssia keräävänä objektiivina. Dikroinen säteenjakaja asennetaan optiselle tielle 45 asteen kulmassa optiseen akseliin nähden. Viritysvalo heijastuu objektiiviin ja fokusoituu näytteeseen. Näytteen tuottama fluoresenssi sekä objektiivin ja peitinlasien pinnoilta heijastuva viritysvalo saapuvat samanaikaisesti objektiivin linssiin ja palaavat dikroiseen säteenjakajaan, joka erottaa viritysvalon fluoresenssista. Jäljellä oleva viritysvalo absorboituu sitten sulkusuodattimeen.
Vaihtamalla suodatinlohkoja erilaisiin virityssuodattimen, dikroisen säteenjaon ja sulkusuodattimen yhdistelmiin voidaan täyttää eri fluoresoivien reaktiotuotteiden vaatimukset. Tämän tyyppisen fluoresenssimikroskoopin etuja ovat tasainen kentän valaistus, terävä kuvantaminen ja fluoresenssin intensiteetin lisääminen suuremmilla suurennoksilla.
