Fluoresenssimikroskoopin periaate ja rakenne
Fluoresenssimikroskoopissa käytetään korkean valotehokkuuden pistevalolähdettä, joka lähettää tietyn aallonpituuden valoa (kuten ultraviolettivaloa 3650 tuumaa tai violettia sinistä valoa 4200 tuumaa) värisuodatusjärjestelmän kautta viritysvalona ja virittää näytteessä olevat fluoresoivat aineet säteilevät erilaisia fluoresenssivärejä. Sen jälkeen sitä tarkkaillaan suurentamalla objektiivia ja okulaaria. Tällä tavoin se on heikolla fluoresenssillakin helposti tunnistettavissa ja erittäin herkkä voimakkaiden kontrastien taustalla, jota käytetään pääasiassa solurakenteen ja toiminnan sekä kemiallisen koostumuksen tutkimiseen. Fluoresenssimikroskoopin perusrakenne koostuu tavallisesta optisesta mikroskoopista ja eräistä lisävarusteista (kuten fluoresoiva valonlähde, virityssuodatin, bikromaattinen säteen erotin ja estosuodatin jne.). Fluoresoivat valonlähteet - käyttävät yleensä ultrakorkeapaineisia elohopealamppuja (50-200W), jotka voivat lähettää valoa eri aallonpituuksilla. Jokaisella fluoresoivalla aineella on kuitenkin viritysvalon aallonpituus, joka tuottaa voimakkaimman fluoresenssin, joten virityssuodattimia (yleensä ultravioletti-, purppura-, sininen ja vihreä virityssuodattimet) on lisättävä, jotta vain tietyn aallonpituuden viritysvalo pääsee kulkemaan läpi ja valaisemaan. näyte absorboi samalla kaiken muun valon. Viritetyllä valolla säteilytettyään jokainen aine emittoi näkyvää fluoresenssia pidemmällä aallonpituudella kuin säteilytys hyvin lyhyessä ajassa. Fluoresenssi on spesifistä ja yleensä heikompaa kuin viritysvalo. Tietyn fluoresenssin havaitsemiseksi objektiivin taakse on lisättävä estävä (tai vaimentava) suodatin. Sillä on kaksi toimintoa: ensinnäkin se absorboi ja estää viritysvaloa pääsemästä okulaariin välttääkseen häiritsevän fluoresenssia ja vahingoittamasta silmiä; toiseksi se valitsee ja sallii spesifisen fluoresenssin kulkea läpi näyttäen tietyn fluoresenssivärin. Molemmat suodatintyypit on valittava käytettäväksi yhdessä.
Fluoresenssimikroskooppeja on kahta tyyppiä niiden optisen polun perusteella:
1. Transmissiofluoresenssimikroskooppi: Viritysvalolähde välitetään näytemateriaalin läpi kondensaattorin kautta fluoresenssin virittämiseksi. Yleisesti käytettyjä pimeän kentän valonkerääjiä tai tavallisia valonkerääjiä voidaan käyttää heijastimen säätämiseen viritysvalon ja sivuvalon muuntamiseksi näytteeseen. Tämä on suhteellisen vanhanaikainen fluoresenssimikroskooppi. Sen etuna on, että fluoresenssi on vahva pienellä suurennuksella, kun taas sen haittana on, että fluoresenssi heikkenee suurennuksen kasvaessa. Siksi se on parempi tarkastella suurempia näytemateriaaleja.
2. Putoavan säteen fluoresenssimikroskooppi Tämä on uudentyyppinen fluoresenssimikroskooppi, joka on kehitetty nykyaikana. Toisin kuin edellinen, viritysvalo putoaa alas objektiivilinssistä näytteen pintaan käyttämällä samaa objektiivilinssiä kuin valaistuskondensaattori ja objektiivilinssi fluoresenssin keräämiseen. Optiselle tielle, joka on 45 asteen kulmassa kevyeen uraaniin nähden, on lisättävä kaksoisvärisäteen erotin. Viritysvalo heijastuu objektiiviin ja keskittyy näytteeseen. Näytteen tuottama fluoresenssi sekä objektiivin ja suojalasin pinnalta heijastuva viritysvalo menevät samanaikaisesti objektiivin linssiin ja palaavat dikroiseen säteen erottimeen erottaen virityksen ja fluoresenssin. Sulkusuodatin absorboi sitten jäännösvirityksen. Jos käytetään erilaisia virityssuodattimia / kaksivärisiä erottimia / estosuodattimien yhdistelmiä, ne voivat täyttää erilaisten fluoresoivien reaktiotuotteiden tarpeet. Tämän fluoresoivan mikroskoopin etuna on, että näkökentän valaistus on tasainen, kuvantaminen on selkeää ja mitä suurempi suurennus, sitä voimakkaampi fluoresenssi.
