Biologisten mikroskooppien optiset ominaisuudet
Mikroskoopin optinen suorituskyky määräytyy seuraavien kahdeksan optisen perusparametrin (tai parametrin) perusteella:
(1) Numeerinen aukko
Numeerista aukkoa kutsutaan myös peilisuhteeksi. Se viittaa havaittavan kohteen ja linssin välisen väliaineen taitekertoimen n ja objektiivin linssikulman puolen siniarvon tuloon. Käytä NA:ta tai A:ta edustamaan. NA=nsin( /2)
Ns. peilisuun kulma viittaa objektiivin etulinssiin tulevien havaitun pisteen reunasäteiden väliseen kulmaan.
Numeerinen aukko on tärkeä objektiivilinssin ja kondensaattorilinssin parametri, ja se liittyy läheisesti muihin mikroskoopin optisiin parametreihin. Yleensä toivotaan, että mitä suurempi, sen parempi. Kaavasta voidaan nähdä, että numeerista aukkoa voidaan lisätä kahdella tavalla, toinen on suurentaa peilin suukulmaa ja toinen on suurentaa objektiivin ja näytteen välistä taitekerrointa.
Kun edellinen menetelmä otetaan käyttöön, näyte ja esine voidaan pitää mahdollisimman lähellä. Mutta ei väliä kuinka lähellä, se on aina alle 180 astetta. Siten sin( /2) on myös pienempi kuin 1. Ilman taitekerroin on n=1. Siksi kuivan objektiivin linssin numeerinen aukko nsin( /2) on aina pienempi kuin 1, yleensä välillä 0,04 ja 0,95.
Kun käytetään jälkimmäistä menetelmää, objektiivin ja näytteen väliin voidaan lisätä väliainetta, jolla on korkeampi taitekerroin. Esimerkiksi setriöljyn taitekerroin on n=1.515. Kun setriöljyä käytetään väliaineena, numeerinen aukko voi olla yli 1,2. Tästä syystä joissakin tapauksissa käytetään öljylaseja. Tällä hetkellä suurin numeerinen aukko, jonka öljylinssi voi saavuttaa, on 1,4.
(2) Päätöslauselma
Resoluutiota kutsutaan myös erotteluasteeksi tai ratkaisuvoimaksi. Ns. resoluutio viittaa mikroskoopin kykyyn erottaa tarkasteltavan kohteen hieno rakenne. Se on kääntäen verrannollinen resoluution etäisyyteen. Resoluutioetäisyys viittaa kahden objektipisteen väliseen vähimmäisetäisyyteen, joka voidaan erottaa. Mitä pienempi erotusetäisyys on, sitä suurempi on mikroskoopin resoluutio. Jos kahden kohdepisteen välinen etäisyys on pienempi kuin resoluutioetäisyys, kaksi pistettä erehtyvät yhdeksi pisteeksi, eikä sen rakennetta voida nähdä selvästi. Mikroskoopin resoluutio määräytyy objektiivin linssin mukaan. Okulaarit vain suurentavat eivätkä lisää mikroskoopin resoluutiota.
Normaalin keskusvalon tapauksessa objektiivin linssin erotusetäisyys d määritetään seuraavalla kaavalla.
d=(λ/2)N.A.
Kaavassa: d edustaa resoluutioetäisyyttä, yksikkö on mikroni, λ edustaa valaistusvalon aallonpituutta, yksikkö on myös mikroni.
Näkyvässä valossa kirkkain ja ihmissilmälle herkin aallonpituus on {{0}},55 μm ja objektiivin linssin suurin NA on 1,4. Korvaamalla yllä olevaan kaavaan d on noin 0,2 μm. Eli tavallisella optisella mikroskoopilla resoluutioetäisyyden raja on 0,2 μm keskusvalaistuksen tapauksessa. Toisin sanoen tavalliset optiset mikroskoopit eivät pysty erottamaan kahta kohdetta, jotka ovat pienempiä kuin 0,2 μm.
Ultraviolettivaloa käyttämällä valaistusvalon aallonpituutta voidaan pienentää, jolloin resoluutioetäisyys saavuttaa 0,1 μm. Mutta ultraviolettisäteitä ihmissilmä ei näe. Sen voi havaita vasta kuvan ottamisen jälkeen.
Elektronivirran aallonpituus on vain 0.00387nm. Käyttämällä "elektronilinssiä" tai magneettilinssiä elektronien virran ohjaamiseen, elektronimikroskoopin resoluutioetäisyys on jopa muutama nanometrin kymmenesosa. Sen avulla voidaan tarkkailla atomien rakennetta.
(3) Suurennus
Mikroskoopin suurennus on yhtä suuri kuin objektiivin linssin ja okulaarin suurennuksen tulo. Periaatteessa suurennus voidaan tehdä hyvin suureksi. Jos objektiivi ei kuitenkaan pysty ratkaisemaan näytteen yksityiskohtia, riippumatta siitä, kuinka suuri suurennus on, se on merkityksetöntä. Teoreettisesti voidaan päätellä, että mikroskoopin sopivin suurennus (kutsutaan tehokkaaksi suurennoksi, jota edustaa M tehokkaasti) on 500-1000 kertaa objektiivin numeerinen aukko. Eli 500N.A. Pienempi tai yhtä suuri kuin M efektiivinen Pienempi tai yhtä suuri kuin 1000N.A.
Tehokkaalla suurennusalueella silmät voivat tarkkailla pitkään ilman väsymystä. Jos suurennus on pienempi kuin 500 NA, sitä on vaikea havaita. Jos se on suurempi kuin 1000N.A., se heikentää kuvan laatua ja aiheuttaa jopa epätodellisen kuvan. Siksi suurennus yli 1000N.A. kutsutaan virheelliseksi suurennoksi.
(4) Työetäisyys
Työetäisyydellä tarkoitetaan objektiivin alapinnan ja suojalasin yläpinnan välistä etäisyyttä sen jälkeen, kun mikroskooppi on tarkennettu, kun käytetään tavallista peitelasia ja standardia mekaanista putken pituutta. Mitä suurempi objektiivilinssin suurennus on, sitä lyhyempi työskentelyetäisyys. Yleensä pienitehoisen objektiivin toimintaetäisyys alle 10 kertaa on 5-7mm, kun taas 100-kertaisen öljylinssin työetäisyys on vain noin 0,19 mm.
(5) Tarkennuksen syvyys
Kun mikroskooppi tarkennetaan tietylle tasolle näytteessä, ei vain kohteen taso voi nähdä selvästi, vaan myös siihen liittyvät ylempi ja alempi kohdetaso näkyvät samalla selvästi. Kohteen ylä- ja alatason välistä etäisyyttä kutsutaan tarkennuksen syvyydeksi tai lyhyesti tarkennuksen syvyydeksi.
Mikroskoopin tarkennussyvyys on hyvin pieni, ja mitä suurempi numeerinen aukko, sitä suurempi kokonaissuurennus ja pienempi tarkennussyvyys. Esimerkiksi käytettäessä öljylinssiä, jonka NA on 1,25/100 kertaa ja jonka okulaari on 12,5-kertainen, tarkennussyvyys on vain 0,27 μm. Eli tarkennuksen jälkeen vain ohut 0,27 μm paksu kerros näkyy kerralla selvästi. Tavalliset näytteet ovat yleensä useita mikroneja paksuja. Koko näytteen näkemiseksi on tarpeen käyttää mikroskoopin hienosäätömekanismia ja tarkkailla kerroksittain ylhäältä alas.
(6) näkökenttä
Näkökenttää kutsutaan myös näkökenttään. Viittaa tarkastettavan kohteen laajuuteen, jonka mikroskooppi voi nähdä kerralla. Yleensä haluamme, että näkökenttä on mahdollisimman suuri. Mikroskoopin näkökenttä määräytyy objektiivin linssin näkökentän ja okulaarin näkökentän perusteella. Tavallisen objektiivilinssin näkökenttä on alle 20 mm ja suuren objektiivin näkökenttä voi olla yli 40 mm. Tavallisten 10x okulaarien näkökenttä on 14 mm ja isojen okulaarien ulottuvuus yli 24 mm. Kun objektiivi ja okulaari on suunniteltu, niiden näkökenttä on kiinteä. Koska yleismikroskoopin näkökenttä on pieni, on mahdotonta nähdä koko näytettä yhdessä näkökentässä, vain hyvin pieni ympyrä näytteestä näkyy. Lisäksi näkökentän koko on kääntäen verrannollinen mikroskoopin kokonaissuurennukseen. Mitä suurempi kokonaissuurennus, sitä pienempi on näkökenttä. Ratkaisu on käyttää liikutinta, jotta jokainen näytteen osa tulee vuorotellen näkökenttään ja tarkkailee vuorotellen.
(7) Peilin kirkkaus
Peilin kirkkaus tarkoittaa mikroskoopissa näkyvän objektikuvan vaaleutta ja tummuutta. Havainnon helpottamiseksi toivomme, että tuloksena oleva kuva on kirkkaampi. Kun kyseessä on jatkuva ulkovalo, peilin kirkkaus on verrannollinen numeerisen aukon neliöön ja kääntäen verrannollinen kokonaissuurennuksen neliöön. Jotta kuvasta tulee kirkkaampi, on käytettävä suurella numeerisella aukolla varustettua objektiivilinssiä, jossa on pieni suurennos. Esimerkiksi, jos kyseessä on sama objektiivilinssi, 5X okulaari tuottaa peilikuvan, joka on 4 kertaa kirkkaampi kuin käytettäessä 10X okulaaria.
Sähköisiä valonlähteitä käyttävissä mikroskoopeissa peilikuvan kirkkautta voidaan säätää säätämällä valaisimen kirkkautta.
(8) Selkeys
Mikroskoopin kuvantamisen selkeys riippuu sen optisesta järjestelmästä, erityisesti objektiivin optisesta suorituskyvystä. Se liittyy mikroskooppien suunnitteluun, valmistukseen, käyttöön ja varastointiin. Se on tärkeä ja monimutkainen kysymys. Käytön ja säilytyksen kannalta tärkeimmät selkeyteen vaikuttavat syyt ovat: käytetyn suojalasin paksuus on epämääräinen, tarkennusta ei ole säädetty ihanteelliseen asentoon, kokonaissuurennus on liian suuri ja öljyn linssi linssiä ei pyyhitty. Puhdas, linssi hometta jne.
