Monifotonimikroskooppikuvaustekniikka: polarisaatio-ratkaistu toisen-harmonisen sukupolven mikroskopia ja sen kuvankäsittely
Epälineaarisissa optisissa mikroskoopeissa toisen harmonisen sukupolven (SHG) kuvantamista käytetään yleisesti endogeenisten kuiturakenteiden tarkkailuun, ja SHG:n intensiteetti riippuu suurelta osin tulevan säteen polarisaatiosuunnan ja kohdemolekyylin orientaatioakselin välisestä suhteellisesta kulmasta. Siksi polarisaatioon perustuva SHG-kuvaus (P-SHG) voi saada rakenneinformaatiota kohdemolekyyleistä analysoimalla toiminnallista suhdetta SHG-signaalin intensiteetin ja tulevan säteen polarisaatiotilan välillä. Sitä käytetään nykyään tärkeänä työkaluna lääketieteellisessä ja biologisessa analyysissä.
Yksinkertaisia SHG-kuvia voidaan saada perinteisellä kaksi{0}}fotoniviritysfluoresenssimikroskopialla (TPM). Useimmat TPM-järjestelmät käyttävät edelleen yksisäteen skannausmenetelmää, joka perustuu liikkuvaan peiliin, jonka aikaresoluutio riippuu peilin fyysisestä liikenopeudesta. Nopeamman kuvantamisen saavuttamiseksi TPM-järjestelmä voi ottaa käyttöön myös monisäteisen skannausmenetelmän (kuva 1A), joista yksi on käyttää pyörivää levyskannausyksikköä. Tämä yksikkö koostuu koaksiaalisesta mikrolinssilevysoittimesta ja neulanreikälevysoittimesta, ja kunkin levysoittimen mikrolinssit ja neulanreiät vastaavat yhtä-to-yksittä.
Kun laser kulkee mikrolinssilevyn läpi, aaltorintama peittää useita mikrolinssejä. Erilaiset mikrolinssit tarkentavat aaltorintaman eri osat eri paikkoihin ja kulkevat vastaavien neulanreikien läpi muodostaen useita mikrosäteitä. Nämä näytteeseen osuvat mikrosäteet voivat samanaikaisesti herättää useita signaaleja. Nämä signaalit palaavat mikroskooppijärjestelmää pitkin ja kulkevat jälleen neulanreiän läpi, ja lopulta heijastuu kahden levysoittimen välisestä dikroisesta peilistä tunnistuslaitteeseen. Valonlähteenä yleisesti käytetyllä tilalukitulla-titaanisafiirilaserilla on kuitenkin riittämätön energia, mikä rajoittaa virityssäteiden määrää ja johtaa pieneen teholliseen näkökenttään (FOV) TPM:lle (TPM{5}}SD) pyörivää skannausyksikköä käytettäessä.
Ai Goto et ai. Tavoitteena oli nopea-P-SHG-kuvaus suurella näkökentällä (FOV) käyttämällä TPM-SD-järjestelmää. Siksi TPM-SD-järjestelmään lisättiin Yb-pohjainen laserlähde, jolla on suurempi huipputeho.
Tämä on kaavio heidän kehittämänsä TPM{0}}SD-järjestelmästä. Järjestelmän valonlähde on Yb-pohjainen laser, joka tuottaa femtosekunnin pulsseja, joiden keskiaallonpituus on 1042 nm, keskiteho 4 W, pulssin leveys 300 fs ja toistotaajuus 10 MHz. Järjestelmä säätää ensin lasertehon puoliaaltolevyn ja Glan-laserpolarisaattorin kautta ja laajentaa sitten säteen säteen laajentimen kautta. Laajennettu säde viedään kääntöpöydän skannausyksikköön, ja skannausyksiköstä tulevat useat mikrosäteet kohdistetaan useisiin näytteen pisteisiin vesiimmersioobjektiivin kautta. Objektiivilinssin valonsäteen polarisaatiotilan säätämiseksi virityssäteen optiselle tielle asetetaan puoliaaltolevy ja neljännesaaltolevy.
