Menetelmät monifotonimikroskooppien tarkennussyvyyden laajentamiseksi
Kahden fotonin laserpyyhkäisymikroskoopin ja kalsium-indikaattorin yhdistelmä on kultainen standardi in vivo -hermosolujen signaalien havaitsemisessa. Neuraaliverkkojen neuronit ovat jakautuneet kolmiulotteiseen tilaan, ja niiden toimintadynamiikan seuranta vaatii keinoa parantaa nopeasti tilavuuskuvausnopeutta. Kuitenkin käyttämällä hilapyyhkäisyä monifotonimikroskooppia kuvaamaan suurta määrää kuvia, jos suuren numeerisen aukon (NA) objektiivia käytetään korkeamman lateraalisen resoluution saavuttamiseksi, se johtaa pienempään polttosyvyyteen. Tilavuuskuvan saamiseksi pienellä polttosyvyydellä,
On tarpeen suorittaa Z-akselin skannaus jollakin tavalla, kuvaten monia tasoja skannaamalla jokainen polttotaso, mikä rajoittaa suuresti kuvantamisnopeutta. Jos aksiaalinen kuvainformaatio voidaan uhrata ja tilavuusskannaus voidaan saavuttaa yhdellä lateraalisella skannauksella laajentamalla tarkennuksen syvyyttä, eli äänenvoimakkuustiedot heijastetaan yhteen 2D-kuvaan, kuvantamisnopeutta voidaan parantaa huomattavasti. Tätä kutsutaan Extended Depth of Focus (EDF) -kuvaukseksi, joka on erityisen hyödyllinen kuvattaessa harvat väestörakenteet, jotka vaativat korkeaa ajallista resoluutiota, kuten esim.
hermosolujen toiminnan toiminnallisena kuvantamisena.
Mikroskoopin aksiaaliset ja lateraaliset resoluutiot määräytyvät objektiivin numeerisen aukon (NA) mukaan. Korkea NA voi maksimoida aksiaalisen ja lateraalisen resoluution sekä kerätyn valon määrän; Pienempi NA johtaa pienempään aksiaaliseen resoluutioon eli pidemmälle tarkennussyvyydelle, mutta samalla uhraa sivuttaisresoluutioa ja valonkeräystehokkuutta. Seuraavaksi esiteltävällä tarkennussyvyyden laajentamismenetelmällä voidaan saavuttaa tämä säilyttäen samalla korkea sivuresoluutio ja riittävä valovirta.
Tilavalomodulaattoreiden käytöllä polttopisteen ohuiden Bessel-säteiden tuottamiseen voidaan saavuttaa EDF-kuvaus, mutta spatiaaliset valomodulaattorit ovat tilaa vieviä ja vaikeasti yhteensopivia kapeiden mikroskooppitilojen kanssa. Sitä vastoin aksiaalisiin pyramideihin perustuvat Bessel-moduulit ovat halpoja ja kompakteja, mutta ne voivat tuottaa vain kiinteän syvyyspolttopisteitä eivätkä sovellu erilaisiin kokeisiin, jotka edellyttävät jatkuvaa polttosyvyyden muutosta. Tämän ongelman ratkaisemiseksi vuonna 2018 RONGWEN LU et al. esitteli Besselin moduulin, joka perustuu aksikoniin, jossa vain yksi linssi on siirrettävä optista akselia pitkin Besselin polttopisteen aksiaalisen pituuden säätämiseksi jatkuvasti.
