Edullinen fluoresenssi ja kirkaskenttämikroskoopin muotoilu
Tässä oppaassa käyn läpi fluoresenssimikroskopian perusperiaatteet ja kolmen erilaisen edullisen fluoresenssimikroskoopin rakentamisen. Nämä järjestelmät maksavat tyypillisesti tuhansia dollareita, mutta viimeaikaiset toimet ovat tehneet niiden hankkimisesta helpompaa. Tässä esittelemässäni suunnittelussa käytetään älypuhelimia, dSLR- ja USB-mikroskooppeja. Kaikkia näitä malleja voidaan käyttää myös avokenttämikroskooppeina.
Vaihe 1: Fluoresenssimikroskopian yleiskuvaus
Ymmärtääksesi fluoresenssimikroskopian peruskäsitteet, kuvittele tiheitä metsiä, puita, eläimiä, pensaita ja muita metsiä, jotka elävät metsässä öisin. Jos valaistat taskulampun metsään, näet kaikki nämä rakenteet ja on vaikea kuvitella tiettyjä eläimiä tai kasveja. Olettaen, että olet kiinnostunut vain mustikkapensaiden näkemisestä metsässä. Tämän saavuttamiseksi sinun on koulutettava tulikärpäsiä houkuttelemaan vain mustikkapensaat, jotta metsää katsoessa vain mustikkapensaat palavat. Voit sanoa, että merkitsit mustikkapensaat tulikärpäsillä, jotta näet mustikkarakenteet metsässä.
Tässä analogiassa metsä edustaa koko näytettä, mustikkapensas edustaa rakennetta, jonka haluat visualisoida (kuten tiettyjä soluja tai subsellulaarisia organelleja), ja tulikärpäset ovat fluoresoivia yhdisteitä. Tilanne ampua taskulampulla yksin ilman tulikärpäsiä on samanlainen kuin kirkaskenttämikroskoopilla.
Seuraava askel on ymmärtää fluoresoivien yhdisteiden (tunnetaan myös nimellä fluoroforit) perustoiminnot. Fluoresoivat klusterit ovat itse asiassa pieniä esineitä (nanomittakaava), jotka on suunniteltu yhdistämään näytteen tiettyjä rakenteita. Ne absorboivat valoa kapealla aallonpituusalueella ja lähettävät uudelleen toisen aallonpituuden valoa. Esimerkiksi fluoresoiva ryhmä voi absorboida sinistä valoa (eli fluoresoiva ryhmä viritetään sinisellä valolla) ja lähettää sitten taas vihreää valoa. Yleensä tämä summataan viritys- ja emissiospektrien avulla (kuten yllä olevasta kuvasta näkyy). Nämä kaaviot osoittavat fluoroforin absorboiman valon aallonpituudet ja fluoroforin lähettämän valon aallonpituudet.
Mikroskoopin rakenne on hyvin samanlainen kuin tavallisen avokenttämikroskoopin, kahdella pääerolla. Ensinnäkin näytettä valaisevan valon tulee olla virittyneen fluoresoivan ryhmän aallonpituudella (yllä olevassa esimerkissä valo on sininen). Toiseksi mikroskoopin tarvitsee vain kerätä säteilevää valoa (vihreää valoa) samalla kun se estää sinisen valon. Tämä johtuu siitä, että sinistä valoa on kaikkialla, mutta vihreä valo tulee vain tietyistä näytteen rakenteista. Sinisen valon estämiseksi mikroskoopeissa on yleensä pitkäpäästösuodatin, joka päästää vihreän valon läpi ilman sinistä valoa. Jokaisella pitkäpäästösuodattimella on raja-aallonpituus. Jos valon aallonpituus on suurempi kuin raja-aallonpituus, se voi kulkea suodattimen läpi. Siksi nimi on "Long Distance Pass". Lyhyemmät aallonpituudet estetään.
Vaihe 2: Mikroskoopin mallintaminen optisella optiikalla
Tämä on lisävaihe mikroskoopin perusperiaatteen suunnittelussa. Fluoresenssimikroskooppia ei tarvitse rakentaa, joten jos et halua syventyä optiikkaan, voit jättää sen väliin.
Sekä kirkaskenttä- että fluoresenssimikroskoopit voidaan mallintaa sädeoptisilla laitteilla. Sädeoptiikan peruslähtökohta on, että valo käyttäytyy samankaltaisesti kuin valon, joka etenee valonlähteestä poispäin. Kun katsot ympärillesi huoneessa, näet auringonvalon ikkunan ulkopuolella tai hehkulampun tuoman valon. Sitten valo absorboituu tai heijastuu huoneessa oleviin esineisiin. Heijastunut valo saa sen silmiisi päin. Jos kohde on valaistu, voit kuvitella kohteen jokaisen pisteen säteilevän valoa kaikkiin suuntiin (kuten yllä olevassa kuvassa näkyy). Linssi, kuten linssi silmissämme, kohdistaa valon johonkin pisteeseen, jotta voimme nähdä kohteen. Ilman linssiä valo etenee edelleen ulospäin eikä muodosta kuvaa.
