Johdatus erilaisten optisten mikroskooppien luokitteluun ja käyttöön
Optisten mikroskooppien luokittelumenetelmiä on monia: käytettyjen okulaarien lukumäärän mukaan ne voidaan jakaa binokulaarisiin ja monokulaarisiin mikroskooppeihin; sen mukaan, onko kuvassa stereovaikutelma, se voidaan jakaa stereomikroskooppeihin ja ei-stereomikroskooppeihin; havaintoobjektin mukaan se voidaan jakaa biologisiin mikroskooppeihin ja kultamikroskooppeihin. mikroskooppi. Vaihe mikroskooppi, jne.; optisen periaatteen mukaan se voidaan jakaa polarisoituun valomikroskooppiin, vaihekontrastimikroskooppiin ja differentiaaliseen häiriömikroskooppiin jne.; valonlähteen tyypin mukaan se voidaan jakaa tavalliseen valoon, fluoresenssiin, ultraviolettivaloon, infrapunavaloon ja lasermikroskooppiin jne.; Vastaanottimen tyypin mukaan se voidaan jakaa Visioniin, digitaaliseen (kamera)mikroskooppiin jne. Yleisesti käytettyjä mikroskooppeja ovat binokulaarinen stereomikroskooppi, metallografinen mikroskooppi, polarisoitu valomikroskooppi, fluoresenssimikroskooppi jne.
1. Binokulaarinen stereomikroskooppi
Binokulaarinen stereomikroskooppi, joka tunnetaan myös nimellä "kiinteä mikroskooppi" tai "leikkauspeili", on visuaalinen instrumentti, jolla on positiivinen stereoskooppinen tunne. Sitä käytetään laajasti leikkauskirurgiassa ja mikrokirurgiassa biolääketieteen alalla; teollisuudessa sitä käytetään pienten osien ja integroitujen piirien tarkkailuun, kokoamiseen ja tarkastukseen. Sillä on seuraavat ominaisuudet:
(1) Kaksikanavaista optista reittiä käytettäessä kiikarin putken vasen ja oikea säde eivät ole yhdensuuntaisia, vaan niillä on tietty kulma - tilavuuden katselukulma (yleensä 12 astetta -15 astetta), eli vasen ja oikea palkki. Molemmat silmät tarjoavat kolmiulotteisen kuvan. Se on pohjimmiltaan kaksi vierekkäistä yksiputkimikroskooppia. Kahden linssin kotelon optisten akselien muodostama katselukulma vastaa katselukulmaa, joka muodostuu, kun henkilö tarkkailee kohdetta molemmilla silmillään muodostaen siten kolmiulotteisen visuaalisen kuvan kolmiulotteisessa tilassa.
(2) Kuva on suora, helppo käyttää ja leikata, koska okulaarin alla oleva prisma kääntää kuvan ylösalaisin.
(3) Vaikka suurennus ei ole yhtä hyvä kuin perinteisessä mikroskoopissa, sen toimintaetäisyys on pitkä.
(4) Polttosyvyys on suuri, mikä on kätevää tarkasteltavan kohteen koko kerroksen tarkkailuun.
(5) Näkökentän halkaisija on suuri.
Nykyisen stereoskoopin optinen rakenne on seuraava: tavallisen pääobjektiivin läpi kaksi valonsädettä kohteen kuvantamisen jälkeen erotetaan kahdella väliobjektiivisarjalla - zoom-objektiivit muodostavat yleisen katselukulman ja kuvataan sitten vastaavien okulaarien läpi. , muuttamalla peiliryhmien välistä etäisyyttä sen suurennuksen muutoksen saamiseksi, joten sitä kutsutaan myös "Zoom-stereomikroskoopiksi". Sovellusvaatimusten mukaan nykyinen stereoskooppi voidaan varustaa runsaasti valinnaisia lisävarusteita, kuten fluoresenssi, valokuvaus, videokuvaus, kylmä valonlähde jne.
2. Metallografinen mikroskooppi
Metallografinen mikroskooppi on mikroskooppi, jota käytetään erityisesti läpinäkymättömien esineiden, kuten metallien ja mineraalien, metallografisen rakenteen tarkkailuun. Näitä läpinäkymättömiä esineitä ei voida tarkkailla tavallisilla läpäisevällä valomikroskoopilla, joten tärkein ero metallografian ja tavallisten mikroskooppien välillä on, että edellinen käyttää heijastunutta valoa, kun taas jälkimmäinen käyttää valaistukseen läpäisevää valoa. Metallografisessa mikroskoopissa valonsäde lähetetään objektiivin suunnasta havaitun kohteen pintaan, heijastuu kohteen pinnalta ja palautetaan sitten objektiiviin kuvaamista varten. Tätä heijastava valaistusmenetelmää käytetään laajalti myös integroitujen piirien piikiekkojen tarkastuksessa.
3. Polarisoiva mikroskooppi
Polarisoivat mikroskoopit ovat mikroskooppeja, joita käytetään niin kutsuttujen läpinäkyvien ja läpinäkymättömien anisotrooppisten materiaalien tutkimiseen. Kaikki kahtaistaitteiset aineet voidaan erottaa selvästi polarisoivassa mikroskoopissa. Tietenkin näitä aineita voidaan havaita myös värjäyksellä, mutta jotkut eivät ole mahdollisia ja on käytettävä polarisoivia mikroskooppeja.
(1) Polarisoivien mikroskooppien ominaisuudet
Menetelmä tavallisen valon muuttamiseksi polarisoiduksi valoksi mikroskopiaa varten sen tunnistamiseksi, onko aine yhtä taittava (kaikkiin suuntiin) vai kahtaistaittava (anisotrooppinen). Kahtaistaitteisuus on kiteiden perusominaisuus. Siksi polarisoituja valomikroskooppeja käytetään laajalti mineraaleissa, kemiassa ja muilla aloilla, ja niillä on myös sovelluksia biologiassa, kasvitieteessä ja muilla aloilla.
(2) Polarisoidun valomikroskoopin perusperiaate
Polarisoidun valomikroskopian periaate on monimutkaisempi, joten en esittele sitä tässä liikaa. Polarisoivassa mikroskoopissa tulee olla seuraavat varusteet: polarisaattori, analysaattori, kompensaattori tai vaihelevy, erityinen jännitteetön objektiivilinssi, pyörivä vaihe.
(3) Polarisoiva mikroskooppimenetelmä
Tavallaan. Ortoskooppi: Tunnetaan myös vääristymättömänä mikroskoopina, ja sille on ominaista vähäsuurennoksen käyttäminen Bertrand-objektiivin sijasta kohteen tutkimiseen. Suora tutkimus polarisoidulla valolla. Samanaikaisesti, jotta valaistusaukko pienenee, kondensaattorin ylempi linssi työnnetään erilleen. Normaalifaasimikroskooppia käytetään kohteen kahtaistaittavuuden tutkimiseen.
b. Konoskooppi: Tunnetaan myös häiriömikroskoopina, se tutkii häiriökuvioita, jotka syntyvät, kun polarisoitu valo häiritsee. Tätä menetelmää käytetään kohteen yksi- tai biaksiaalisuuden tarkkailuun. Tässä menetelmässä valaistukseen käytetään voimakkaasti suppenevaa polarisoitua valonsädettä.
(4) Polarisointimikroskooppeja koskevat vaatimukset
Tavallaan. Valonlähde: On parasta käyttää monokromaattista valoa, koska valon nopeus, taitekerroin ja häiriöilmiöt vaihtelevat aallonpituuksien mukaan. Yleismikroskoopit voivat käyttää tavallista valoa.
b. Okulaarit: Okulaarit, joissa on hiusristikko.
C. Lauhdutin: Yhdensuuntaisen polarisoidun valon saamiseksi tulee käyttää ulospäin kääntyvää lauhdutinta, joka voi työntää ylemmän linssin ulos.
d. Bertrand-linssi: apuelementti kondensaattorin optisella polulla, joka on apulinssi, joka vahvistaa kohteen aiheuttaman primäärivaiheen toissijaiseksi vaiheeksi. Se takaa objektiivin takapolttotasolle muodostetun tasomaisen häiriökuvion havainnoinnin okulaarilla.
(5) Polarisoimismikroskooppeja koskevat vaatimukset
Tavallaan. Lavan keskipiste on koaksiaalinen optisen akselin kanssa.
b. Polarisaattorin ja analysaattorin tulee olla kvadratuuriasennossa.
C. Ammunta ei saa olla liian ohutta.
4. Fluoresenssimikroskopia
Fluoresenssimikroskopia käyttää lyhyen aallonpituuden valoa säteilyttääkseen fluoreseiinilla värjäytyneen kohteen kiihottaakseen ja tuottaakseen pitkän aallonpituuden fluoresenssia ja sitten tarkkailemaan. Fluoresenssimikroskopiaa käytetään laajalti biologiassa, lääketieteessä ja muilla aloilla.
(1) Fluoresenssimikroskoopit jaetaan yleensä kahteen tyyppiin: lähetystyyppi ja epi-valaisutyyppi.
Tavallaan. Lähetystyyppi: Viritysvalo säteilee tarkasteltavan kohteen pohjapinnalta ja kondensaattori on tummakenttäkondensaattori, joten viritysvalo ei pääse objektiivin linssiin ja fluoresenssi tulee objektiivin linssiin. Se on kirkas pienellä suurennuksella ja tumma suurella suurennuksella. Öljyimmersio- ja neutralointitoimenpiteet ovat vaikeita, varsinkin pienen suurennoksen valaistusaluetta on vaikea määrittää, mutta hyvin tummia taustoja voidaan saada. Läpäisevää tyyppiä ei käytetä läpinäkymättömille tarkastuskohteille.
Vaihteistotyyppi on tällä hetkellä lähes eliminoitu. Useimmat uudet fluoresenssimikroskoopit ovat epitaksiaalisia. Valonlähde tulee testikohteen yläpuolelta ja optisella tiellä on säteenjakaja, joka sopii läpinäkyville ja läpinäkymättömille testikohteille. Koska objektiivi toimii kondensaattorina, se ei ole vain helppokäyttöinen, vaan sillä voidaan myös saavuttaa tasainen valaistus koko näkökentässä pienestä suurennokseen asti.
(2) Varotoimet fluoresenssimikroskopiaa varten
Tavallaan. Pitkäaikainen altistuminen viritysvalolle aiheuttaa fluoresenssin heikkenemistä ja sammumista, joten havaintoaikaa tulee lyhentää mahdollisimman paljon. .
b. Käytä öljyn katseluun "ei-fluoresoivaa öljyä".
C. Fluoresenssi on lähes aina heikkoa ja se tulisi suorittaa pimeässä huoneessa.
d. On parasta asentaa jännitteen stabilaattori virtalähteeseen, muuten jännitteen epävakaus ei vain lyhennä elohopealampun käyttöikää, vaan vaikuttaa myös mikroskoopin vaikutukseen.
Tällä hetkellä monia nousevia biologisia tutkimusaloja sovelletaan fluoresenssimikroskopiatekniikoihin, kuten geeniin situ -hybridisaatioon (FISH).
5. Vaihekontrastimikroskooppi
Optisen mikroskoopin kehityksessä onnistunut vaihekontrastimikroskoopin keksintö on tärkeä saavutus nykyaikaisessa mikroskooppitekniikassa. Tiedämme, että ihmissilmä pystyy erottamaan vain valoaaltojen aallonpituuden (värin) ja amplitudin (kirkkauden). Värittömissä ja läpinäkyvissä biologisissa näytteissä valon läpäiseessä aallonpituus ja amplitudi eivät juuri muutu, joten näytettä on vaikea havaita kirkkaassa kentässä. .
Vaihekontrastimikroskoopin tarkoituksena on käyttää tarkastetun kohteen optista polkueroa mikroskooppisen havainnoinnin suorittamiseen, toisin sanoen käyttää tehokkaasti valon interferenssiilmiötä muuttaakseen vaihe-eron, jota ihmissilmä ei pysty erottamaan, erottuvaksi amplitudieroksi, jopa jos se on väritöntä ja läpinäkyvää. Aine voi myös tulla selvästi näkyväksi. Tämä helpottaa suuresti elävien solujen havainnointia, joten faasikontrastimikroskopiaa käytetään laajalti käänteismikroskoopeissa.
Vaihekontrastimikroskooppi eroaa laitteiden kirkkaasta kentästä ja sillä on joitain erityisvaatimuksia:
a. Asennettu lauhduttimen alle ja yhdistetty lauhdutin - vaihekontrastilauhduttimeen. Se koostuu levylle asennetuista erikokoisista rengasmaisista kalvoista, joiden ulkopuolella on sanat 10X, 20X, 40X, 100X jne., joita käytetään objektiivien kanssa vastaavilla kerrannaisilla.
b. Vaihelevy: Asennettu objektiivin takapolttotasolle, se on jaettu kahteen osaan, joista toinen on osa, jonka läpi suora valo kulkee, joka on läpikuultava rengas, jota kutsutaan konjugaattitasoksi. toinen on se osa, jonka kautta taipunut valo "kompensoi" . Vaihelevyillä varustettuja objektiiveja kutsutaan "vaihekontrastiobjektiiviksi", ja koteloon kirjoitetaan usein sana "Ph".
Faasikontrastimikroskopia on suhteellisen monimutkainen mikroskopiamenetelmä. Hyvän havaintovaikutuksen saavuttamiseksi mikroskoopin virheenkorjaus on erittäin tärkeää. Lisäksi on huomioitava seuraavat seikat:
Tavallaan. Valonlähteen tulee olla vahva ja kaikkien aukkokalvojen tulee olla auki;
b. Käytä värisuodattimia tehdäksesi valoaalloista lähes yksivärisiä.
6. Differenttial Interference Contrast Microscopy (Diffe Rent Interference Contrast DIC)
Differentiaalinen interferenssikontrastimikroskopia ilmestyi 1960-luvulla. Se ei voi vain tarkkailla värittömiä ja läpinäkyviä esineitä, vaan myös esittää vahvoja stereoskooppisia kuvia, ja sillä on joitain etuja, joita vaihekontrastimikroskopia ei voi saavuttaa. , havaintovaikutus on realistisempi.
(1) Periaatteet
Differentiaalinen interferenssikontrastimikroskopia käyttää erityisiä Wollaston-prismoja säteen hajottamiseksi. Halkaistujen säteiden värähtelysuunnat ovat kohtisuorassa toisiinsa nähden ja intensiteetti on sama. Tarkastettavan kohteen läpi kulkevan säteen kaksi pistettä ovat hyvin lähellä toisiaan ja vaiheet ovat hieman erilaisia. Koska kahden valonsäteen välinen erotusetäisyys on erittäin pieni, ei ole haamukuvia, mikä saa kuvan näyttämään kolmiulotteiselta.
(2) Differentiaalihäiriökontrastimikroskoopissa vaadittavat erikoisosat:
a. Polarisaattori
b. Analysaattori
C. 2 Wollaston-prismaa
(3) Varotoimet differentiaalihäiriökontrastimikroskopiassa
Tavallaan. Differentiaalisen häiriön suuren herkkyyden vuoksi levyn pinnalla ei saa olla likaa ja pölyä.
b. Kahtaistaitteiset aineet eivät voi saavuttaa differentiaalisen interferenssin kontrastimikroskopian vaikutusta.
C. Muovisia petrimaljoja ei voida käyttää käytettäessä differentiaalista interferenssiä käänteiseen mikroskooppiin.
7. Käänteinen mikroskooppi (Invertedmicroscope)
Käänteinen mikroskooppi soveltuu kudosviljelmän, in vitro -soluviljelmän, planktonin, ympäristönsuojelun, elintarviketarkastuksen jne. mikroskooppiseen tarkkailuun biolääketieteen alalla.
Edellä mainittujen näyteominaisuuksien rajoituksista johtuen tarkastettavan esineen sijoittaminen petrimaljaan (tai viljelypulloon) vaatii pitkän työskentelyetäisyyden käänteisen mikroskoopin objektiivista ja lauhduttimesta, ja petrimaljassa oleva tarkastettu esine voi tarkastettava suoraan. Mikroskooppinen havainto ja tutkimus. Siksi objektiivilinssin, kondensaattorilinssin ja valonlähteen asennot ovat kaikki käänteisiä, joten sitä kutsutaan "käänteismikroskoopiksi".
Työetäisyysrajoitusten vuoksi käänteisten mikroskooppien objektiivien suurin suurennus on 60X. Yleensä käänteismikroskoopit tutkimuskäyttöön on varustettu 4X, 10X, 20X ja 40X vaihekontrastiobjektiivilla, koska käänteisiä mikroskooppeja käytetään enimmäkseen värittömään ja läpinäkyvään in vivo -havaintoon. Jos käyttäjällä on erityistarpeita, voidaan valita myös muita lisävarusteita, jotka täydentävät differentiaalisen häiriön, fluoresenssin ja yksinkertaisen polarisoidun valon havainnointia.
Käänteisiä mikroskooppeja käytetään laajalti patch clampissa, siirtogeenisessä ICSI:ssä ja muilla aloilla.
8. Digitaalinen mikroskooppi
Digitaalinen mikroskooppi on mikroskooppi, joka käyttää kameraa (eli televisiokameran objektiivia tai varaukseen kytkettyä laitetta) vastaanottavana elementtinä. Mikroskoopin todelliselle kuvapinnalle on asennettu kamera korvaamaan ihmissilmä vastaanottimena. Optoelektroninen laite muuntaa optisen kuvan sähköiseksi signaalikuvaksi ja suorittaa sitten koon havaitsemisen ja hiukkasten laskennan. Tämän tyyppistä mikroskooppia voidaan käyttää yhdessä tietokoneen kanssa havainnoinnin ja tietojenkäsittelyn automatisoinnin helpottamiseksi, ja sitä käytetään enimmäkseen tilanteissa, jotka vaativat paljon työlästä havaitsemistyötä.
2. Erilaisten optisten mikroskooppien käyttö
Fluoresenssimikroskopia käyttää näytteen lähettämää fluoresenssia kohteiden tarkkailuun;
Stereomikroskoopeilla voidaan tarkkailla esineiden kolmiulotteisia kuvia;
Projektiomikroskooppi voi heijastaa kohteen kuvan projektiokankaalle, jotta useat ihmiset voivat tarkkailla sitä samanaikaisesti;
Käänteiset mikroskoopit soluviljelyyn, kudosviljelyyn ja mikrobitutkimukseen;
Faasikontrastimikroskooppia käytetään värittömien ja läpinäkyvien näytteiden tarkkailuun;
Esimerkiksi pimeyden kenttämikroskopiaa käytetään bakteerien ja spirokeettien tarkkailuun. urheilullinen.
