Kuinka fluoresenssimikroskopia eroaa perinteisestä mikroskopiasta
Yritin äskettäin tehdä hiiristä jäädytettyjä leikkeitä, ja nyt minun on käytettävä fluoresenssimikroskooppia nähdäkseni, onko injektoimani virus halutulla aivoalueella. Joitakin fluoresenssimikroskopian perusperiaatteita on tutkittava lyhyesti, ja jaan ne myös täällä.
Fluoresenssimikroskooppi käyttää ultraviolettivaloa valonlähteenä testattavan kohteen valaisemiseen, jolloin kohde lähettää valonlähdettä ja tarkkaile sitten kohdetta mikroskoopin alla. Sitä käytetään pääasiassa immunofluoresenssisoluihin, ja se koostuu valonlähteestä, suodatinlevyjärjestelmästä ja optisesta järjestelmästä, joka tarkkailee näytteen fluoresenssikuvaa okulaarin ja objektiivin suurennuksen kautta. Katsotaanpa tämän fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen optisen mikroskoopin eroa.
1. Valaistusmenetelmien suhteen
Fluoresenssimikroskoopin valaistusmenetelmänä käytetään yleensä putoavan säteen menetelmää, mikä tarkoittaa, että valonlähde heijastetaan testinäytteeseen objektiivin läpi.
2. Mitä tulee resoluutioon
Fluoresenssimikroskopia käyttää valonlähteenä ultraviolettivaloa, jonka aallonpituus on suhteellisen lyhyt, mutta resoluutio on suurempi kuin tavalliset optiset mikroskoopit.
3. Suodattimen erot
Fluoresenssimikroskoopissa käytetään kahta erityistä suodatinta, joista toinen valonlähteen edessä suodattaa näkyvän valon ja toinen objektiivin ja okulaarin välissä ultraviolettivaloa, joka voi suojata silmiä.
Fluoresenssimikroskopia on myös eräänlainen optinen mikroskooppi, pääasiassa siksi, että fluoresenssimikroskoopilla viritetty aallonpituus on lyhyt, mikä johtaa eroihin fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen mikroskoopin rakenteessa ja käytössä. Useimmilla fluoresenssimikroskoopeilla on hyvä toiminto siepata heikkoa valoa, joten niiden kuvantamiskyky on hyvä myös erittäin heikon fluoresenssin alla. Lisäksi fluoresenssimikroskopian jatkuvan parantamisen myötä viime vuosina melu on myös vähentynyt merkittävästi. Siksi fluoresenssimikroskooppeja käytetään yhä enemmän.
Kaksifotonifluoresenssimikroskopiaan liittyvä tieto
Kaksifotoniviritteen perusperiaate on, että suurella fotonitiheydellä fluoresoivat molekyylit voivat samanaikaisesti absorboida kaksi pitkän aallonpituuden fotonia ja lyhyen ns. virittyneen tilan elinajan jälkeen emittoi lyhyemmän aallonpituuden fotonin; Sen vaikutus on sama kuin käytettäessä fotonia, jonka aallonpituus on puolet pitkästä aallonpituudesta, virittämään fluoresoivia molekyylejä. Kahden fotonin heräte vaatii suurta fotonitiheyttä, ja solujen vaurioitumisen välttämiseksi kaksifotonimikroskoopissa käytetään korkean energian tilalukittua pulssilaseria. Tämän tyyppisen laserin lähettämällä laserilla on korkea huippuenergia ja alhainen keskimääräinen energia, pulssin leveys on vain 100 femtosekuntia ja taajuus jopa 80-100 megahertsiä. Käytettäessä suuren numeerisen aukon objektiivia pulssilaserin fotonien tarkentamiseen, fotonitiheys objektiivin polttopisteessä on suurin ja kahden fotonin viritys tapahtuu vain objektiivin polttopisteessä. Siksi kaksifotonimikroskooppi ei vaadi konfokaalisia neulanreikiä, mikä parantaa fluoresenssin havaitsemisen tehokkuutta.
Yleisissä fluoresenssiilmiöissä virityksen alhaisesta fotonitiheydestä johtuen fluoresoiva molekyyli voi absorboida vain yhden fotonin samanaikaisesti ja lähettää sitten yhden fluoresoivan fotonin säteilysiirtymän kautta, jota kutsutaan yksittäisfotonifluoresenssiksi. Fluoresenssiviritysprosessissa, jossa käytetään laseria valonlähteenä, voi esiintyä kaksi- tai jopa monifotonisia fluoresenssiilmiöitä. Tällä hetkellä käytetty viritysvalolähde on voimakas ja fotonitiheys täyttää fluoresoivien molekyylien vaatimuksen absorboida kaksi fotonia samanaikaisesti. Käytettäessä tyypillistä laseria viritysvalonlähteenä fotonitiheys ei vieläkään riitä synnyttämään kahden fotonin absorptioilmiötä. Tyypillisesti käytetään femtosekuntipulssilasereita, joiden hetkellinen teho voi saavuttaa megawatin tason. Siksi kahden fotonin fluoresenssin aallonpituus on lyhyempi kuin virityksen, mikä vastaa puolen viritysaallonpituuden herätteen tuottamaa vaikutusta.
