Fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen optisen mikroskoopin erot ja ominaisuudet
Fluoresenssimikroskooppi ja tavallinen optinen mikroskooppi eroavat toisistaan, näytettä ei tarkkailla tavallisen valonlähteen valaistuksen kautta, vaan tietyn valon aallonpituuden (yleensä ultravioletti, sinivioletti valo) fluoresoivan materiaalin viritys näytteen sisällä mikroskoopin alla, jotta fluoresenssimikroskoopin valonlähteen fluoresenssi ei toimi suorana valaistuksena, vaan eräänlaisena fluoresoivan materiaalin viritysnä energialähteen näytteen sisällä. Syy siihen, miksi voimme tarkkailla näytettä, ei johdu valonlähteen valaistuksesta, vaan fluoresenssiilmiöstä, jonka näytteessä oleva fluoresoiva materiaali aiheuttaa virityksen valoenergian absorboitumisen jälkeen. Voidaan nähdä, että fluoresenssimikroskoopin ominaisuudet, pääasiassa sen valonlähde, voivat tuottaa suuren määrän tiettyä viritysvalon aallonpituusaluetta, jotta tutkittavassa näytteessä oleva fluoresoiva materiaali voi saada tarvittavan viritysvalon intensiteetin. Samalla fluoresenssimikroskoopissa on oltava vastaava suodatinjärjestelmä. Fluoresenssimikroskooppi on fluoresenssihistokemian perustyökalu. Se koostuu ultrakorkean paineen valonlähteestä, suodatinjärjestelmästä (mukaan lukien viritys- ja vaimennussuodatinlevy), optisesta järjestelmästä ja valokuvausjärjestelmästä ja muista tärkeistä komponenteista, ja se on tietyn valon aallonpituuden käyttö stimuloimaan näytettä lähettämään fluoresenssia.
1. Fluoresenssivirityksen tapa: aallonpituusalueen mukaan valo jaetaan UV-viritysmenetelmään (käyttämällä ultraviolettivalaistusta) ja BV-viritysmenetelmään (käyttäen sinistä violettia valoa) kahden tyyppinen UV-viritysmenetelmä on lyhyempi kuin 400 nm lähellä ultraviolettivaloa jännitystä. Tässä menetelmässä ei ole näkyvää viritysvaloa, joten havaittu fluoresenssi osoittaa väriaineen luontaisen fluoresenssin ja on helppo erottaa näytteen spesifinen fluoresenssi taustakudoksen itsefluoresenssista.
2. BV-viritysmenetelmä: Menetelmä keskittyy 404 nm:iin, 434 nm ultraviolettisäteilystä siniseen valoon viritystä varten. Tämä menetelmä käyttää sinistä valoa näytteen säteilyttämiseen, joten fluoresenssihavaintojärjestelmän rajasuodattimen on käytettävä suodatinta, joka voi estää sinisen valon kokonaan ja läpäistä halutun vihreän ja keltaisen fluoresenssin riittävästi. Fluoresoivat pigmentit fluoresoivaan vasta-ainemenetelmään. Koska viritysvalon maksimiabsorption aallonpituus ja fluoresenssin maksimiemission aallonpituus ovat lähellä toisiaan, tulee BV-viritysmenetelmässä käytettävien suodattimien olla teräviä katkaisusuodattimia. Tämä menetelmä käyttää sinistä valoa viritysvalona, jolloin fluorokromin absorptiotehokkuus on korkeampi ja saadaan kirkkaampi kuva. Haittapuolena on, että fluoresenssia alle 500 nm ei voida nähdä ja yli 500 nm koko kuva näyttää keltaiselta. Fluoresoivassa vasta-ainemenetelmässä suurin osa spesifisyydestä arvioidaan fluorokromin ainutlaatuisen värin perusteella, joten yllä kuvatun BV-viritysmenetelmän haitoilla on taipumus olla äärimmäisen vaikuttavia, kun keskustellaan hienovaraisesta spesifisyydestä.
