Konfokaalisen lasermikroskoopin ominaisuudet ja sovellukset
Laserpyyhkäisykonfokaalinen mikroskooppi (LSCM) on mikroskoopin tyyppi, joka perustuu konjugaattifokusointitekniikkaan, eli laservalonlähteen, testattavan näytteen ja ilmaisimen saattamiseksi konjugaattiasennossa toisiinsa.
Perusteellista
Yleismikroskoopeissa objektiivin linssin polttotaso osuu ilmaisimen kanssa siten, että havainnollinen kuvataso on eristetty viereisestä aksiaalitasosta, kun taas konfokaalimikroskoopeissa näytettä valaistaan käyttämällä diffraktiorajoitettua valopistettä. Tämä eristysvaikutus saavutetaan käyttämällä pistekonjugaatin polttopisteessä olevaa neulanreikää hajavalon suodattamiseksi erottelukyvyn parantamiseksi.
Kuvausominaisuudet
Vain konjugoidusta näytekerroksesta takaisin heijastuva valo voi kulkea keräysvalopolun pienen reiän läpi, ja jäljelle jääneet epäolennaiset näytekerroksen heijastukset estetään pienellä reiällä. Tämä voi lisätä resoluutiota merkittävästi. Alla on saman paksun näytteen moniulotteisen fluoresenssimikroskopian ja konfokaalimikroskopian rinnakkainen vertailu. Kun sarja kuvia otetaan eri polttotasoilla, voidaan luoda ns. "z-pino", ja tämä kuva näyttää sekä konfokaalimikroskopian tarjoaman resoluution ja kontrastin parannukset että näiden vahvistusten taustalla olevat syyt. Kun pinon yläosassa olevaa kuvaa tutkitaan kuvantamistason ollessa kudoksen yläpuolella, fluoresenssikuvassa näkyy paljon hajavaloa, kun taas konfokaalinen kuva näyttää mustalta. Tämä PSF:n väheneminen aksiaalisessa suunnassa on suoraan vastuussa erottelukyvystä, joka havaitaan optisessa rajapinnassa z-pinon keskellä.
Toinen laserskannauskonfokaalimikroskopian ominaisuus on, että se on skannaava kuvantamistekniikka. Perinteinen laajakenttävalotekniikka valaisee koko näytteen, joten kuva voidaan ottaa suoraan paljaalla silmällä tai ilmaisimella, mutta LSCM käyttää sädettä tai Useita kohdistettuja säteitä kulkee näytteen läpi skannaukseen ja kuvantamiseen, ja tuloksena oleva kuva on kutsutaan optiseksi osaksi. Seuraavassa on esitetty ero perinteisen laajakentän valaistusmenetelmän ja laserkeilaavan konfokaalisen valaistusmenetelmän välillä.
Siksi alla olevassa kuvassa on esitetty nykyaikaisen konfokaalimikroskoopin käytännöllinen työskentelytapa. Laserin lähettämä viritysvalo kulkee dikroisen peilin läpi ja skannaa näytteen x- ja y-suunnassa värähtelevien peilien läpi. Näytteen viritys (tai heijastus) Valo tulee PMT-ilmaisimeen neulanreiän kautta ja tallennetaan, ja tietokone rekonstruoi tallennetun skannauskuvan todellisen näytekuvan saamiseksi.
