Erot fluoresenssimikroskooppien ja tavallisten valomikroskooppien välillä
Fluoresenssimikroskoopit eroavat perinteisistä optisista mikroskoopeista. Sen sijaan, että tarkasteltaisiin näytteitä tavallisen valonlähteen valolla, ne käyttävät tietyn aallonpituuden valoa (yleensä ultraviolettivaloa tai siniviolettia valoa) fluoresoivien aineiden virittämiseen mikroskoopin objektilasilla olevan näytteen sisällä, jolloin nämä aineet emittoivat fluoresenssia. Siksi fluoresenssimikroskoopin valonlähde ei suoraan valaise näytettä; se toimii energialähteenä näytteessä olevien endogeenisten fluoresoivien aineiden virittämiseksi. Emme näe näytettä itse valonlähteestä tulevan valaistuksen takia, vaan siksi, että näytteen sisällä olevat fluoresoivat aineet absorboivat viritysvaloenergiaa ja lähettävät sitten fluoresenssia.
Tästä seuraa, että fluoresenssimikroskoopin avainominaisuus on, että sen valonlähde voi tuottaa viritysvaloa tietyllä aallonpituuskaistalla, mikä mahdollistaa tarkastetun näytteen fluoresoivien aineiden emittoivan riittävän voimakasta fluoresenssia. Sillä välin fluoresenssimikroskooppi on varustettava vastaavalla suodatinjärjestelmällä. Se on välttämätön instrumentti fluoresenssihistokemiassa. Fluoresenssimikroskooppi koostuu pääasiassa ultrakorkeapaineisesta valonlähteestä, suodatinjärjestelmästä (mukaan lukien virityssuodattimet ja sulkusuodattimet), optisesta järjestelmästä ja valokuvausjärjestelmästä. Se toimii käyttämällä tietyn aallonpituuden valoa fluoresoivien aineiden virittämiseen.
① Fluoresenssiviritysmenetelmät Viritysvalon aallonpituusalueen mukaan on kahta tyyppiä: UV-viritysmenetelmä (ultraviolettivalaisumenetelmä) ja BV-viritysmenetelmä (siniviolettivalomenetelmä). UV-viritysmenetelmässä käytetään ultraviolettivaloa, joka on lyhyempi kuin 400.nm:n viritys. Se tuottaa näkymätöntä fluoresenssia, joten havaittu fluoresenssi tulee itse näytteestä. Tämä menetelmä erottaa helposti spesifisen fluoresenssin taustan autofluoresenssista.
② BV-viritysmenetelmä BV-viritysmenetelmässä käytetään viritysvaloa, joka vaihtelee violetista siniseen ja jonka keskipiste on 404 nm ja 434 nm. Koska näytteen säteilyttämiseen käytetään sinistä valoa, tämän menetelmän virityssuodatinjärjestelmän on estettävä sininen valo kokonaan ja päästävä vain vaaditun vihreän ja keltaisen valon läpi. Fluoresoivassa vasta-ainevärjäyksessä viritysvalon maksimiabsorptioaallonpituus on lähellä fluoresoivan väriaineen suurinta emissioaallonpituutta. Tästä syystä BV-herätyksen suodatinsarjassa on käytettävä sulkusuodatinta. Tämä menetelmä käyttää viritykseen sinistä valoa, joten fluoresenssin keräysteho on suhteellisen korkea ja kirkkaampia kuvia voidaan saada. Sen haittana on, että yli 500 nm:n fluoresenssia ei voida havaita, ja vain keltavihreitä kuvia voidaan nähdä yli 500 nm:ssä. Fluoresoivassa vasta-ainevärjäyksessä spesifisyyden arviointi riippuu suuresti väriinformaatiosta, joten BV-viritysmenetelmän haittapuoli voi olla suuri rajoitus, kun keskustellaan hienovaraisesta spesifisyydestä.
