Fluoresenssimikroskooppien ja tavallisten optisten mikroskooppien väliset erot ja ominaisuudet
Fluoresenssimikroskooppi eroaa tavallisesta optisesta mikroskoopista siinä, että se ei havaitse näytteitä tavallisten valonlähteiden valaistuksessa. Sen sijaan se käyttää tiettyä valon aallonpituutta (yleensä ultraviolettivaloa, siniviolettivaloa) virittääkseen näytteen sisällä olevat fluoresoivat aineet mikroskoopin alla, jolloin ne emittoivat fluoresenssia. Siksi valonlähteen rooli fluoresenssimikroskoopissa ei ole suora valaistus, vaan energialähde näytteen sisällä olevien fluoresoivien aineiden virittämiseksi. Syy siihen, miksi voimme tarkkailla näytteitä, ei johdu valonlähteen valaistuksesta, vaan fluoresenssiilmiöstä, jonka näytteen sisällä olevat fluoresoivat aineet osoittavat, kun ne ovat absorboineet viritetyn valoenergian. Tästä voidaan nähdä, että fluoresenssimikroskopian ominaisuus on pääasiassa se, että sen valonlähde pystyy tuottamaan suuren määrän viritysvaloa tietyllä aallonpituusalueella, jolloin näytteessä olevat fluoresoivat aineet voivat saada tarvittavan viritysvalon intensiteetin. Samanaikaisesti fluoresenssimikroskoopeissa on oltava vastaavat suodatinjärjestelmät. Fluoresenssimikroskooppi on perusväline fluoresenssikudoskemiassa. Se koostuu pääkomponenteista, kuten ultra-korkeajännitevalolähteestä, suodatinjärjestelmästä (mukaan lukien viritys- ja vaimennussuodatinlevyt), optinen järjestelmä ja valokuvausjärjestelmä. Se käyttää tietyn aallonpituuden valoa näytteen virittämiseen ja fluoresenssin lähettämiseen.
1. Fluoresenssivirityksen menetelmät: Valon aallonpituusalueen mukaan on kahta tyyppiä: UV-viritysmenetelmä (käyttämällä ultraviolettivaloa) ja BV-viritysmenetelmä (käyttäen siniviolettia valoa). UV-viritysmenetelmässä käytetään viritykseen alle 400 nm:n lähellä ultraviolettivaloa. Tässä menetelmässä ei ole näkyvää viritysvaloa, joten havaittu fluoresenssi osoittaa väriaineen luontaista fluoresenssia, mikä tekee näytteen spesifisen fluoresenssin erottamisen helposti taustakudoksen omasta fluoresenssista.
2. BV-viritysmenetelmä: Se sisältää virityksen ultraviolettisäteilystä siniseen valoon, jonka keskipiste on 404 nm ja 434 nm. Tämä menetelmä käyttää sinistä valoa näytteen säteilyttämiseen, joten fluoresenssihavaintojärjestelmän katkaisusuodattimen on käytettävä suodatinta, joka voi estää sinisen valon kokonaan ja läpäistä vaaditun vihreän ja keltaisen fluoresenssin. Fluoresoivassa vasta-ainemenetelmässä käytetyt fluoresoivat pigmentit. Viritysvalon maksimiabsorptioaallonpituus ja fluoresenssin maksimiemissioaallonpituus ovat suhteellisen lähellä toisiaan, joten BV-viritysmenetelmässä käytettävässä suodattimessa tulee käyttää teräväleikkaussuodatinta. Tällä menetelmällä voidaan käyttää sinistä valoa viritysvalona, jolloin fluoresoivien pigmenttien absorptiotehokkuus on korkea ja saadaan kirkkaampia kuvia. Haittapuolena on, että alle 500 nm:n fluoresenssia ei voida nähdä, kun taas yli 500 nm:n fluoresenssi saa koko kuvan näyttämään keltaiselta. Fluoresoivassa vasta-ainemenetelmässä spesifisyyden määrää enimmäkseen fluoresoiville pigmenteille omaperäinen väri, joten hienovaraisesta spesifisyydestä puhuttaessa yllä mainituilla BV-viritysmenetelmän haitoilla on usein merkittävä vaikutus.
