Mikro-organismien lukumäärän määritys - mikroskoopin suora laskentamenetelmä!
Bakteeripopulaation kasvu ilmenee solujen määrän lisääntymisenä tai solumassan kasvuna. Solumäärän määritysmenetelmiä ovat suora mikroskooppilaskentamenetelmä, levypesäkkeiden laskentamenetelmä, valosähköinen öljysuhdemenetelmä, maksimitodennäköisyysmenetelmä ja kalvosuodatusmenetelmä. Soluaineen mittausmenetelmiä ovat solun kuivapainon määritys, tiettyjen solukomponenttien, kuten typpi-, RNA- ja DNA-pitoisuuden, sekä metaboliittien määritys. Lyhyesti sanottuna mikro-organismien kasvun mittaamiseen on monia menetelmiä, joista jokaisella on omat etunsa ja haittansa, ja ne tulisi valita erityistilanteen mukaan. Tässä kokeessa esitellään pääasiassa tuotannossa ja tieteellisessä tutkimuksessa yleisesti käytetty mikroskoopin suoralaskentamenetelmä.
1. Käyttötarkoitusvaatimukset
1. Selvitä verisolujen määrän periaate.
2. Hallitse menetelmä mikro-organismien laskentaan verisolulaskurin avulla.
2. Perusperiaatteet
Mikroskoopin suoralaskentamenetelmä on yksinkertainen, nopea ja intuitiivinen menetelmä laskea suoraan pieni määrä testattavan näytteen suspensiota erityisellä lasilevyllä, jolla on tietty pinta-ala ja tilavuus (tunnetaan myös bakteerilaskurina). menetelmät. Tällä hetkellä kotimaassa ja ulkomailla yleisesti käytetyt bakteerilaskurit ovat: verisolujen laskentataulu, Peteroff-Hauser-bakteerilaskuri ja Hawksley-bakteerilaskuri jne. Niitä voidaan käyttää hiivan, bakteerien, homeitiöiden ja muiden suspensioiden laskemiseen ja perusperiaate on sama. Kahden jälkimmäisen bakteerilaskurityypin kokonaistilavuus on 0.02mm3 peitelasilla peittämisen jälkeen, ja kansilasin ja objektilasin välinen etäisyys on vain 0,02 mm, joten öljy immersioobjektiivilla voidaan tarkkailla pieniä soluja, kuten bakteereja. Kreivi. Näiden bakteriometrien lisäksi on olemassa myös estimointimenetelmä, jolla määritetään sivelypinta-alan suhde suoraan mikroskoopilla havaittuun näkökentän pinta-alaan, jota käytetään yleensä maidon bakteriologiseen tutkimukseen. Mikroskoopin suoran laskentamenetelmän edut ovat intuitiivisia, nopeita ja helppokäyttöisiä. Tämän menetelmän haittana on kuitenkin se, että mitattu tulos on yleensä kuolleiden ja elävien solujen summa. Tällä hetkellä on olemassa joitakin menetelmiä tämän puutteen poistamiseksi, kuten elävien bakteerien yhdistelmä värjäävän mikrokammioviljelmän (lyhyt aika) ja solunjakautumisen estäjien lisäämisen, jotta saavutetaan tarkoitus laskea vain eläviä bakteereja.
Tässä kokeessa hemosytometriä käytettiin esimerkkinä suorasta mikroskooppisesta laskennasta. Katso kahden muun bakteerilaskurityypin käytöstä kunkin valmistajan ohjeista. Laskeminen suoraan mikroskoopin alla hemosytometrillä on yleisesti käytetty menetelmä mikro-organismien laskemiseen. Laskentalevy on erityinen lasiliukumäki, johon on muodostettu kolme alustaa neljällä uralla; keskellä oleva leveämpi taso on jaettu kahteen puolikkaaseen lyhyellä poikittaisella uralla, ja lavan molemmilla puolilla on ristikko. Jokainen ruudukko on jaettu yhdeksään suureen neliöön, ja keskellä oleva suuri neliö on laskentahuone. Verisolujen laskentalevyn rakenne on esitetty kuvassa l{{{{10}}}}. Laskentahuoneen mittakaavassa on yleensä kaksi eritelmää, joista toinen on suuri neliö, joka on jaettu 25 keskimmäiseen neliöön, ja jokainen keskimmäinen neliö on jaettu 16 pieneen neliöön (kuva 15-2); toinen on iso neliö. Neliö on jaettu 16 keskiruutuun ja jokainen keskimmäinen ruutu on jaettu 25 pieneen ruutuun, mutta riippumatta siitä, millainen laskentataulu on kyseessä, jokaisessa suuressa ruudussa on 400 pientä ruutua. Jokaisen suuren neliön sivun pituus on 1 mm ja jokaisen suuren neliön pinta-ala on 1 mm2. Peitelasilla peittämisen jälkeen kansilasin ja liukulasin välinen korkeus on 0,1mm, joten laskentakammion tilavuus on 0,lmm3 (millilitran tuhannesosa). Kuva 15-1 Verisolulaskentataulun rakenne (1) Kuva 15-2 Verisolulaskentataulun rakenne (2) A. Etunäkymä; B. Pituusleikkauskuva; Laajennettu ruudukko, suuri neliö keskellä on laskentakammio 1. Verisolut Laskentalevy; 2. Suojalasi; 3. Kun lasket laskentakammiossa, laske yleensä bakteerien kokonaismäärä viidessä ruudussa, laske sitten kunkin neliön keskiarvo ja kerro 25:llä tai 16:lla saadaksesi. Suuren neliön bakteerien kokonaismäärä muunnetaan sitten bakteerien kokonaismäärä 1 ml:ssa bakteeriliuosta. Olkoon bakteerien kokonaismäärä viidessä neliössä A ja bakteeriliuoksen laimennussuhde B. Jos kyseessä on laskentalevy, jossa on 25 neliötä, bakteerien kokonaismäärä 1 ml:ssa bakteeriliuosta {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(kpl) Vastaavasti, jos kyseessä on laskentalevy, jossa on 16 keskikokoista neliötä, bakteerien kokonaismäärä 1 ml:ssa bakteeriliuosta=A/ 5×16×104×B=32000A·B (kappaletta)
3. Laitteet
1. Bakteerit
Saccharomyces cerevisiae
2. Välineet tai muut välineet
Hemosytometri, mikroskooppi, peitinlasi, steriili kapillaaritippari.
4. Käyttövaiheet
1. Bakteerisuspension valmistus
Saccharomyces cerevisiae valmistettiin sopivan pitoisuuden omaavaksi bakteerisuspensioksi steriilillä fysiologisella suolaliuoksella.
2. Mikroskoopin laskentahuone
Ennen näytteiden lisäämistä tarkasta mikroskooppisesti laskentalevyn laskentakammio. Jos siinä on likaa, se on puhdistettava ja kuivattava ennen laskemista.
3. Lisää näyte
Peitä puhdas ja kuiva hemosytometri peitinlasilla ja pudota sitten steriilillä kapillaaritiputtimella pieni pisara ravistettua Saccharomyces cerevisiae -suspensiota peitinlasin reunalta ja anna bakteeriliuoksen liikkua automaattisesti rakoa pitkin kapillaariosmoosin avulla. Laskuhuoneeseen tullessa yleinen laskentahuone voidaan täyttää bakteerinesteellä. Kun otat näytteen, ravista ensin bakteeriliuosta; näytteitä lisättäessä laskentakammioon ei saa muodostua ilmakuplia.
4. Mikroskoopin laskenta
Kun olet lisännyt näytteen, seiso paikallaan 5 minuuttia, aseta hemosytometri mikroskoopin alustalle, etsi ensin laskentakammion sijainti pienitehoisella mikroskoopilla ja vaihda sitten suurtehoiseen mikroskooppiin laskemista varten. Säädä mikroskoopin valon voimakkuus sopivasti. Valaistukseen peilejä käyttävissä mikroskoopeissa on varottava poikkeamasta valon toiselta puolelta, muuten laskentahuoneen neliömäisiä viivoja ei ole helppo nähdä selvästi näkökentässä tai vain pystysuorat tai vaakasuuntaiset viivat näkyvät. olla nähty. Jos havaitaan, että bakteeriliuos on liian väkevä tai liian laimennettu ennen laskemista, laimennus on säädettävä uudelleen ennen laskentaa. Yleensä näytteen laimennus vaatii noin 5-10 bakteeria jokaisessa pienessä solussa. Jokainen laskentakammio valitsee 5 keskikennoa (valinnainen 4 kulmaa ja yksi keskikenno keskellä) laskemista varten. Ruudukkoviivalla sijaitsevat solut lasketaan yleensä vain ylä- ja oikealla rivillä. Hiivan orastuessa, kun silmun koko saavuttaa puolet emosolusta, se lasketaan kahdeksi bakteerisoluksi. Laskeaksesi näytteen, laske näytteen bakteeripitoisuus laskemalla keskiarvo kahdesta laskentakammiosta.
5. Pese verisolujen määrä
Huuhtele verisolulaskentataulu käytön jälkeen vedellä hanasta, älä hankaa kovilla esineillä ja kuivaa se itse tai hiustenkuivaajalla pesun jälkeen. Mikroskooppinen tutkimus sen havaitsemiseksi, onko kussakin pienessä solussa jäljellä bakteereja tai muita sedimenttejä. Jos se ei ole puhdas, se on pestävä toistuvasti, kunnes se on puhdas.
