Miksi minun on käytettävä konfokaalimikroskooppia?
1. Optista mikroskooppia on kehitetty suurten edeltäjiemme ponnistelujen ja parannusten avulla. Itse asiassa tavallinen mikroskooppi voi tarjota meille kauniita mikroskooppisia kuvia helposti ja nopeasti. Tapahtuma, joka mullisti lähes täydellisten mikroskooppien maailman, oli kuitenkin "laserpyyhkäisykonfokaalimikroskoopin" keksintö. Tälle uudentyyppiselle mikroskoopille on tunnusomaista optinen järjestelmä, joka poimii kuvainformaatiota vain pinnalta, johon tarkennus on keskittynyt, ja muuttamalla tarkennusta samalla kun se palauttaa hankitun tiedon kuvamuistiin, on mahdollista saada terävä kuva täydelliset 3-ulottuvuustiedot. Näin pinnan muodosta voidaan helposti saada tietoa, jota ei voida varmistaa tavanomaisella mikroskoopilla. Lisäksi, vaikka "resoluution lisääminen" ja "tarkennussyvyyden syventäminen" ovat ristiriitaisia olosuhteita tavanomaisille optisille mikroskoopeille, erityisesti suurella suurennuksella, tämä ongelma ratkaistaan konfokaalisilla mikroskoopeilla.
2. Konfokaalisen optisen järjestelmän edut
Laserkonfokaalimikroskoopin kaavio
Konfokaalinen optinen järjestelmä on näytteen pistevalaistus, kun taas heijastunut valo vastaanotetaan myös pistereseptorin avulla. Kun näyte sijoitetaan polttopisteeseen, lähes kaikki heijastunut valo saavuttaa fotoreseptorin, ja kun näyte on epätarkka, heijastunut valo ei pääse fotoreseptoriin. Toisin sanoen konfokaalisessa optisessa järjestelmässä vain polttopisteen kanssa yhteensopiva kuva tulostetaan, ja täplät ja turha hajavalo estetään.
3. Miksi käyttää laseria?
Konfokaalisessa optisessa järjestelmässä näyte valaistaan pisteessä ja heijastunut valo vastaanotetaan pisteanturilla. Siksi pistevalolähde on välttämätön. Laserit ovat hyvin pitkälti pistevalolähde. Useimmissa tapauksissa konfokaalimikroskooppien valonlähde on laservalolähde. Lisäksi laserien monokromaattisuus, suuntaus ja erinomainen säteen muoto ovat tärkeitä syitä niiden laajalle käyttöönotolle.
4. Nopeaan skannaukseen perustuva reaaliaikainen havainnointi on mahdollista.
Laserkeilauksessa käytetään vaakasuunnassa akustista optista poikkeutusyksikköä (Acoustic Optical Deflector, AO prime) ja pystysuunnassa servoelektronisesti ohjattua sädepyyhkäisypeiliä (Servo Galvano-peili). Koska AO Deflectorissa ei ole mekaanista tärinää, nopea skannaus on mahdollista ja reaaliaikainen havainnointi näyttöruudulla on mahdollista. Tämän kameran suuri nopeus on erittäin tärkeä tekijä, joka vaikuttaa suoraan tarkennusnopeuteen ja paikanhakuun.
5. Tarkennusasennon ja kirkkauden välinen suhde
Konfokaalissa optisessa järjestelmässä näyte sijoitetaan oikein polttoasentoon, kun kirkkaus on zui suuri, sen edessä ja takana sen kirkkaus vähenee jyrkästi (kuva 4 yhtenäinen viiva). Tämä polttotason herkkä selektiivisyys on konfokaalimikroskoopin korkeussuunnan ja tarkennuksen laajenemisen syvyyden taustalla oleva periaate. Sitä vastoin tavalliset optiset mikroskoopit eivät näytä mitään merkittävää kirkkauden muutosta ennen ja jälkeen polttopisteen (katkoviiva kuvassa 4).
6. Suuri kontrasti, korkea resoluutio
Perinteisessä optisessa mikroskoopissa mikroskoopin epätarkka-osasta heijastuva valo häiritsee mikroskoopin fokusoitua kuvantamisosaa ja menee päällekkäin sen kanssa, mikä johtaa kuvan kontrastin vähenemiseen. Sitä vastoin konfokaalisessa optisessa järjestelmässä polttopisteen ulkopuolella ja objektiivin sisällä oleva hajavalo poistetaan lähes kokonaan, mikä johtaa erittäin suuren kontrastin omaaviin kuviin. Lisäksi mikroskoopin erotuskyky paranee, koska valo kulkee objektiivin läpi kahdesti ja terävöittää pistekuvaa.
7. Optinen lokalisointitoiminto
Konfokaalisessa optisessa järjestelmässä heijastunut valo suojataan mikroaukolla muussa kuin polttopisteessä. Tämän seurauksena kolmiulotteista näytettä tarkasteltaessa kuva muodostuu ikään kuin näyte olisi viipaloitu polttopisteen kanssa (kuva 5). Tätä vaikutusta kutsutaan optiseksi lokalisoinniksi, ja se on yksi konfokaalisten optisten järjestelmien ominaisuuksista.
