Konfokaalifluoresenssimikroskopian ymmärtäminen
Konfokaalisen fluoresenssimikroskopian perusperiaate: Käytä pistevalolähdettä näytteen valaisemiseen, jolloin muodostuu pieni, tarkasti määritelty valopiste polttotasolle. Objektiivin linssi kerää pisteen lähettämän fluoresenssin valaistuksen jälkeen ja palauttaa sen dikroiseen peiliin alkuperäistä valaistusvalopolkua pitkin. muodostavat säteenjakajan. Spektrometri lähettää fluoresenssin suoraan detektoriin. Valonlähteen ja ilmaisimen edessä on neulanreikä, joita kutsutaan vastaavasti valaistuksen neulanreikiksi ja ilmaisimen reikäksi. Näiden kahden geometriset mitat ovat yhdenmukaiset, noin 100-200nm; suhteessa polttotason valopisteeseen nämä kaksi ovat konjugoituja, toisin sanoen valopiste kulkee linssien sarjan läpi ja voidaan viime kädessä tarkentaa valaistusneulanreikään ja tunnistusneulanreikään samanaikaisesti. Tällä tavalla polttotasosta tuleva valo voidaan keskittää havaintoreiän alueelle, kun taas polttotason ylä- tai alapuolelta sironnut valo on estetty tunnistusreiän ulkopuolelle, eikä sitä voida kuvata. Näyte skannataan laserilla piste pisteeltä, ja tunnistusreiän takana oleva valomonistinputki saa myös piste pisteeltä vastaavan valon konfokaalisen kuvan, joka muunnetaan digitaaliseksi signaaliksi ja lähetetään tietokoneelle ja lopuksi aggregoidaan näytön selkeäksi konfokaaliseksi kuvaksi koko polttotasosta. .
Jokainen polttotason kuva on itse asiassa näytteen optinen poikkileikkaus. Tällä optisella poikkileikkauksella on aina tietty paksuus ja sitä kutsutaan myös optiseksi ohueksi poikkileikkaukseksi. Koska valon intensiteetti tarkennuksessa on paljon suurempi kuin valon intensiteetti ei-tarkennuksessa ja ei-fokusoiva tason valo suodatetaan neulanreiällä, konfokaalijärjestelmän syväterävyys on suunnilleen nolla. Pyyhkäisemällä Z-akselin suuntaa pitkin voidaan toteuttaa optinen tomografia, jolloin muodostuu haluttu Tarkkaile kaksiulotteista optista leikkausta näytteen fokusoidussa kohdassa. Yhdistämällä XY-tason (fokusointitaso) skannaus Z-akselin (optinen akseli) skannaukseen, keräämällä jatkuvia tasoja kaksiulotteisia kuvia ja käsittelemällä niitä erikoistuneella tietokoneohjelmistolla, saadaan näytteestä kolmiulotteinen kuva.
Toisin sanoen tunnistusneulanreikä ja valonlähteen neulanreikä on aina fokusoitu samaan pisteeseen, jolloin tarkennustason ulkopuolella virittynyt fluoresenssi ei pääse tunnistusreikään.
Laserkonfokaalin toimintaperiaatteen yksinkertainen ilmaus on, että se käyttää laseria valonlähteenä. Perinteisen fluoresenssimikroskoopin kuvantamisen perusteella lisätään laserskannauslaite ja konjugaattitarkennuslaite, ja järjestelmää ohjataan tietokoneella digitaalisten kuvien keräämiseksi ja käsittelemiseksi.
