Näytteen valmisteluvaatimukset fluoresenssimikroskopiaa varten
Vaatimukset näytteen valmistelulle fluoresenssimikroskopiaa varten
(1) Lasilasi
Liukulasin paksuuden tulee olla välillä 0.8-L2mm. Liian paksu objektilasi imee toisaalta enemmän valoa ja toisaalta ei voi kohdistaa viritysvaloa näytteeseen. Diojen on oltava sileitä, tasapaksuisia ja vailla ilmeistä autofluoresenssia. Joskus käytetään kvartsilevyjä.
(2) Peitelasi
Peitelasin paksuus on noin 0,17 mm, sileä. Viritysvalon vahvistamiseksi voidaan käyttää myös häiriöpeitelasia, joka on erityinen peitelasi, joka on päällystetty useilla ainekerroksilla (kuten magnesiumfluoridilla), joilla on erilaisia häiriövaikutuksia eri aallonpituuksille valolle, mikä voi tehdä fluoresenssi tasainen. Viritysvalo kulkee läpi, ja viritysvalo heijastuu, ja tämä heijastunut viritysvalo voi virittää näytettä.
(3) Näyte
Kudosviipaleet tai muut näytteet eivät saa olla liian paksuja. Jos paksuus on liian paksu, suurin osa viritysvalosta kuluu näytteen alaosassa, kun taas objektiivin suoraan havaitsemaa yläosaa ei voida täysin virittää. Lisäksi päällekkäisten solujen tai epäpuhtauksien aiheuttama fluoresenssi, taustan epäspesifinen värjäys vaikuttaa arviointiin.
(4) peiliöljy
Yleensä, kun näytteitä tarkastellaan tummakenttäfluoresenssimikroskoopeilla ja öljyimmersiomikroskoopeilla, on käytettävä immersioöljyä. On parasta käyttää erityistä ei-fluoresoivaa immersioöljyä. Sen sijaan voidaan käyttää myös glyseriiniä ja myös nestemäistä parafiinia, mutta taitekerroin on alhainen, mikä vaikuttaa hieman kuvanlaatuun.
Fluoresenssimikroskoopin valokuution ymmärtäminen
Fluoresenssi on valoa, jonka aineen elektronit absorboivat valoenergiaa matalaenergisesta tilasta korkeaenergiseen tilaan ja vapauttavat sitten valoa, kun se palaa matalaenergiseen tilaan. Se on ei-lämpötilasäteilyä - luminesenssia. Eli: aine absorboi lyhytaaltovaloa, siirtyy kiihtyneeseen tilaan ja lähettää pitkäaaltovaloa.
Olipa kyseessä aineen autofluoresenssi, fluoresoiva väriaine tai fuusiossa ilmentyvä fluoresoiva proteiini, se on viritettävä tietyllä valon aallonpituudella (Excitation). Kun elektronit liikkuvat ja menettävät energiaa, ne lähettävät tietyn pitkän aallonpituuden (Emision) valoa. , jotka detektiojärjestelmä voi kerätä spesifisen fluoresenssin tunnistamistoiminnon saavuttamiseksi.
Mikä on fluoresoiva valokuutio?
Fluoresenssimikroskooppihavainnossa ja -kuvauksessa tietyn aallonpituuden viritysvalo ja vastaava pitkäaaltoinen emissiovalo saadaan fluoresenssivalokuutiosta, jotta fluoresenssisignaali voidaan kerätä paljaalla silmällä, näytöllä tai kameralla. Siksi fluoresenssivalokuutio määrittää, mitä voidaan havaita. Fluoresenssisignaalin avainlaite, sen ominaisuuksia ovat EX: viritysaallonpituussuodatinparametrit, EM: emissioaallonpituussuodatinparametrit ja DM: dikotomiset peiliparametrit. Otetaan esimerkkinä Revolven integroidun fluoresenssimikroskoopin DAPI-valokuutio, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425 nm valo voidaan välittää EM; EM-emissiosuodattimia käytetään erottamaan fluoroforin lähettämä fluoresenssi muista taustasta. Optiset elementit valon erottamiseen. Emissiosuodattimet lähettävät valoa fluoresenssin aallonpituudella dikroisen peilin läpi samalla kun ne estävät kaiken muun valon, joka vuotaa viritysvalolähteestä (heijastuu näytteestä tai optiikasta). Lähetetyn valon aallonpituus on suurempi kuin havaittava EM, eli vain 450±25 nm:n alueella oleva valo pääsee tunnistusjärjestelmään. EX-, EM-suodattimien ja DM-dikotomioiden oikea valinta voi auttaa tutkijoita saavuttamaan korkeammat signaali-kohinasuhteet (S/N).
