Fluoresenssimikroskoopin periaate ja sovellus
(1) Fluoresenssimikroskoopin periaate ja rakenteelliset ominaisuudet: fluoresenssimikroskoopissa käytetään korkean valotehokkuuden pistevalolähdettä, joka lähettää tietyn aallonpituuden (kuten ultraviolettivaloa 3650 tuumaa tai purppuransinistä valoa 4200 tuumaa) suodatinjärjestelmän läpi. viritysvalona näytteen virittämiseksi. Kun sisällä oleva fluoresoiva aine emittoi erivärisiä fluoresenssia, se havaitaan objektiivin ja okulaarin suurennuksen kautta. Tällä tavalla voimakkaan kontrastitaustan alla, vaikka fluoresenssi on erittäin heikko, se on helppo tunnistaa ja sen herkkyys on korkea. Sitä käytetään pääasiassa solurakenteen ja toiminnan sekä kemiallisen koostumuksen tutkimukseen. Fluoresenssimikroskoopin perusrakenne koostuu tavallisesta optisesta mikroskoopista sekä eräistä lisävarusteista (kuten fluoresoiva valonlähde, virityssuodatin, kaksivärinen säteen jakaja ja estosuodatin jne.). Fluoresoiva valonlähde - käytetään yleensä ultrakorkeapaineista elohopealamppua (50-200W), joka voi lähettää eri aallonpituuksilla valoa, mutta jokaisella fluoresoivalla aineella on voimakkaimman fluoresenssin tuottava viritysaallonpituus, joten on tarpeen lisätä virityssuodatin (Yleensä on ultravioletti-, violetti-, sininen ja vihreä virityssuodattimia), jotka sallivat vain tietyn aallonpituuden omaavan viritysvalon kulkea ja säteilyttää näytteen samalla, kun ne absorboivat muuta valoa. Kun kutakin ainetta on säteilytetty viritysvalolla, se emittoi näkyvää fluoresenssia pidemmällä aallonpituudella kuin säteilytyksen aallonpituus hyvin lyhyessä ajassa. Fluoresenssi on spesifistä ja yleensä viritysvaloa heikompaa. Tietyn fluoresenssin havaitsemiseksi objektiivin takana tarvitaan estävä (tai vaimentava) suodatin. Sillä on kaksi tehtävää: toinen on absorboida ja estää viritysvaloa pääsemästä okulaariin, jotta se ei häiritse fluoresenssia ja vahingoita silmiä; toinen on valita spesifinen fluoresenssi ja päästää sen läpi näyttäen tiettyä fluoresoivaa väriä. Molempia suodattimia tulee käyttää yhdessä.
Fluoresenssimikroskooppeja on kahta tyyppiä niiden optisten reittien suhteen:
1. Transmissiofluoresenssimikroskooppi: Viritysvalolähde herättää fluoresenssin näytemateriaalin läpi kondensaattorilinssin läpi. Yleisesti käytetään tummakenttäkerääjää, ja tavallisella keräimellä voidaan myös säätää peiliä niin, että viritysvalo välittyy ja ohitetaan näytteeseen. Tämä on vanhanaikainen fluoresenssimikroskooppi. Etuna on, että fluoresenssi on vahva pienellä suurennuksella, ja haittana on, että fluoresenssi pienenee suurennoksen kasvaessa. Siksi se on parempi tarkastella suurempia näytemateriaaleja.
2. Epi-fluoresenssimikroskooppi Tämä on uudentyyppinen fluoresenssimikroskooppi, joka on kehitetty nykyaikana. Erona on se, että viritysvalo putoaa objektiivilinssistä näytteen pintaan, eli samaa objektiivilinssiä käytetään valaistuksen kondensaattorina ja objektiivina fluoresenssin keräämiseen. Dikroinen säteenjakaja on lisättävä valopolkuun, joka on 45 asteen päässä kevyestä uraanista. Viritysvalo heijastuu objektiiviin ja kerätään näytteeseen. Näytteen tuottama fluoresenssi ja objektiivin linssin pinnasta ja suojalasipinnasta heijastuva viritysvalo saapuvat objektiiviin samanaikaisesti ja palaavat kaksiväriseen säteenjakajaan viritysvaloksi. Erotettu fluoresenssista , jäännösviritysvalo absorboituu estosuodattimiin. Jos vaihdat erilaisten virityssuodattimien/kaksiväristen säteenjakajien/sulkusuodattimien yhdistelmään, erilaisten fluoresoivien reaktiotuotteiden tarpeet voidaan täyttää. Tällaisen fluoresenssimikroskoopin etuna on, että näkökentän valaistus on tasainen, kuvantaminen on selkeää ja mitä suurempi suurennus, sitä voimakkaampi fluoresenssi.
(2) Kuinka käyttää fluoresenssimikroskooppia.
1. Kytke valonlähde päälle, ultrakorkeapaineisen elohopealampun on lämmettävä muutaman minuutin ajan, jotta se saavuttaa kirkkaimman pisteen.
2. Transmissiofluoresenssimikroskooppia varten tarvittava virityssuodatin tulee asentaa valonlähteen ja kondensaattorin väliin ja vastaava estosuodatin tulee asentaa objektiivin taakse. Epi-fluoresenssimikroskooppien on asetettava tarvittavat virityssuodatin/kaksoisvärisäteen jakaja/estosuodatinosat valopolun aukkoihin.
3. Tarkkaile pienellä suurennosobjektiivilla ja säädä valonlähteen keskikohta erityyppisten fluoresenssimikroskooppien säätölaitteen mukaan siten, että se sijaitsee koko valaistuspisteen keskellä.
4. Aseta näytearkki ja tarkkaile tarkennuksen jälkeen. Huomio on kiinnitettävä käytön aikana: Älä katso suoraan päätysuodattimeen, jotta et vahingoita silmiä; tarkasteltaessa näytettä öljylinssillä on käytettävä erityistä öljylinssiä ilman fluoresenssia; sen jälkeen, kun korkeapaineelohopealamppu on sammutettu, sitä ei voi sytyttää heti uudelleen, ja se on testattava. Se voidaan käynnistää uudelleen 5 minuutin kuluttua, muuten se on epävakaa ja vaikuttaa elohopealampun käyttöikään.
(3) Tarkkailu Käyttämällä siniviolettia valosuodatinta fluoresoivassa mikroskoopissa opetusalustalla voidaan nähdä, että solut, jotka on värjätty 0,01 prosentilla akridiinioranssilla fluoresoivalla väriaineella, tuma ja sytoplasma viritetään tuottamaan kahta eri väriä fluoresenssi (tumma) vihreä ja oranssinpunainen).
