Optisen mikroskoopin paksuusvaatimukset lasilevyille
Mikroskooppinen dehydraatio ja näytteen kiinnittäminen: Toistuvan sentrifugoinnin vuoksi solut menetetään, joten on parasta kiinnittää solut lasilevyn tai muovilevyn pintaan optista mikroskopiaa varten, jotta solut kuivataan ja kuivataan yhdessä lasin kanssa. liukumäki tai muovilevy. Vaatimukset objektilasien paksuudelle optisessa mikroskopiassa Jotta solut voisivat kiinnittyä objektilaseihin tai muovilevyihin, on ensin asetettava kalvokerros lasilevyille tai muovilevyille. Kalvon asettamismenetelmä on seuraava:
(1) Yksinkertaisin menetelmä optiseen mikroskopiaan on asettaa ohut kerros polyvinyyliformaalikalvoa (formvar). Liota puhdistetut objektilasit (0.5-1)-prosenttisessa polyvinyyliformaalikloroformiliuoksessa. Kun ilmakehä haihtuu, dialle ilmestyy valkoinen kalvo. Ravista objektilaseja useita kertoja kloroformissa, jotta kalvo muuttuu. Ohut ja käyttövalmis.
(2) Pudota 0.1 leveysaste poly-L-lysiiniä (liuota 1 mg polylysiiniä 1 ml:aan suodatettua vettä valmistuksen aikana) puhdistetulle lasilevylle ja laita se 450 C:n syöttölaatikkoon pisaran avautumisen jälkeen. . kuiva. Tämä menetelmä on paras, koska poly-L-lysiini on positiivisesti varautunut, mikä mahdollistaa enemmän pintaan negatiivisesti varautuneiden solujen kiinnittymisen.
(3) Lisää plasmaa ja glyserolia tislattuun veteen suhteessa (30--40) prosenttia ja (3-5) prosenttia optisen mikroskoopin vaatimusten mukaisesti objektilasin paksuudelle glyseroliproteiinin muodostamiseksi. ratkaisu. Neste tiputetaan puhdistetulle lasilevylle, avataan ja kuivataan optisen mikroskoopin alla. Asetettu proteiinikalvo upotetaan 2-prosenttiseen glutaraldehydiin proteiinin kiinnittämiseksi, pestään ja kuivataan myöhempää käyttöä varten. Ennen käyttöä plasma tiputetaan proteiinikalvolle. Tee se "aktivoiduksi", huuhtele puskurilla 30 minuutin kuluttua ja se voidaan levittää suoraan.
Kiinnitetyistä ja puhdistetuista soluista valmistetaan sopiva pitoisuus solususpensiota suodatetulla vedellä digitaalimikroskoopilla ja optinen mikroskooppi asetetaan kalvolla päällystetylle lasilevylle tai muovilevylle ja asetetaan kosteaan, matalaan. lämpötilassa (40C) ympäristössä ( 30-120) minuuttia, jotta solut voivat kiinnittyä kalvoon. Ota lasilevy talteen hienoilla pinseteillä ja ravista sitä puhtaassa kahdesti tislatussa vedessä ja pese kiinnittymättömät solut pois optisella mikroskoopilla. Vaatimukset objektilasien paksuudelle optisissa mikroskoopeissa Polarisoivat mikroskoopit asetetaan sitten nopeasti astiaan, joka on täytetty 50-prosenttisella asetonilla (tai etanolilla). Dehydratointiprosessina objektilasit laitetaan asetoniin tai etanoliin nousevalla pitoisuudella 3 minuutin välein ja optiseen mikroskooppiin tai jatkuvasti lisätään kuivausaineen pitoisuutta lasilasisäiliössä. Kirjoittajan laboratoriokokemuksen mukaan jälkimmäinen toiminta on kätevämpi. Optisen mikroskopian spesifinen menetelmä voi imeä pois puolet säiliössä olevasta vedenpoistoaineesta 3 minuutin välein ja lisätä sitten saman määrän kuivausainetta, jonka pitoisuus on 100 prosenttia. Leikkausten 5-6 jälkeen vedenpoistoaineen pitoisuus mikroskoopin hinta-astiassa saavuttaa yli 0,5 prosentin ja solut kuivataan onnistuneesti. Kriittisen pisteen kuivumisen jälkeen lasilevy tai muovilevy liimataan näytelaiturille johtavalla liimalla metallipinnoitusta varten. Solujen kiinnittäminen kalvoihin on myös mahdollista kolmannella menetelmällä. Optinen mikroskooppi voi ripustaa solut, jotka on kiinnitetty alhaisella glutaraldehydipitoisuudella "aktivoituun" proteiinikalvoon. Optinen mikroskooppi vaatii lasilevyn paksuuden asettamisen 10 minuutiksi, ja objektilasia tai muovilevyä liotetaan 2-prosenttisessa glutaraldehydissä. 30 minuutin kuluttua huuhtele suodatetulla kahdesti tislatulla vedellä ja dehydroi, kuivaa ja metallipinnoite yllä olevan menetelmän mukaisesti.
