Monifotonimikroskooppikuvaus: erilaisia tekniikoita neuronien kuvantamiseen in vivo
Verrattuna perinteiseen yksifotoniseen laajakenttäfluoresenssimikroskooppiin, monifotonimikroskoopilla (MPM) on optinen leikkaus ja syväkuvaus. Vuonna 2019 Jerome Lecoq et al. keskusteltiin liittyvästä MPM-teknologiasta kolmesta näkökulmasta: hermosolujen kuvantaminen syvällä aivoissa, massiivinen neuronikuvaus ja nopea neuronikuvaus.
Hermosolujen toiminnan yhdistämiseksi monimutkaiseen käyttäytymiseen on yleensä tarpeen kuvata neuronit syvässä aivokuoressa, mikä edellyttää MPM:llä syväkuvauksen kykyä. Biologinen kudos hajoaa ja absorboi viritys- ja emissiovaloa voimakkaasti, mikä on tärkein tekijä, joka rajoittaa MPM:n kuvantamissyvyyttä. Vaikka sirontaongelma voidaan ratkaista lisäämällä laserin intensiteettiä, se tuo mukanaan muita ongelmia, kuten näytteen polttamisen, defokusoinnin ja lähellä pintaa olevaa fluoresoivaa viritystä. Paras tapa lisätä MPM-kuvauksen syvyyttä on käyttää pidempiä aallonpituuksia viritysvalona.
Lisäksi kahden fotonin (2P) kuvantamisessa epätarkka ja lähellä pintaa oleva fluoresenssiherätys ovat kaksi suurinta syvyyttä rajoittavaa tekijää, kun taas kolmen fotonin (3P) kuvantamisessa nämä kaksi ongelmaa vähenevät huomattavasti, mutta fluoresenssin aiheuttama kolmen fotonin kuvantaminen Ryhmän absorptiopoikkileikkaus on paljon pienempi kuin 2P:n, joten tarvitaan suuruusluokkaa suurempaa pulssienergiaa saman intensiteetin fluoresenssisignaalin saamiseksi kuin 2P:n virittynyt. Funktionaalinen 3P-mikroskopia on vaativampi kuin rakenteellinen 3P-mikroskopia, joka vaatii nopeampaa skannausta, jotta hermosolujen aktiivisuudesta voidaan ottaa näytteitä ajoissa; tarvitaan suurempaa pulssienergiaa riittävän signaalin keräämiseksi kunkin pikselin viipymäajan sisällä.
Monimutkaisiin käytöksiin liittyy usein suuria aivoverkostoja, joissa on sekä paikallisia että pitkän kantaman yhteyksiä. Hermosolujen toiminnan kytkemiseksi käyttäytymiseen on välttämätöntä seurata erittäin suurten ja laajalle levinneiden hermosolujen toimintaa samanaikaisesti. Aivojen hermoverkko käsittelee saapuvat ärsykkeet kymmenissä millisekunnissa. Tämän nopean hermoverkon ymmärtäminen Neuronidynamiikan tutkimiseksi MPM:ltä vaaditaan kyky kuvata hermosoluja nopeasti. Nopeat MPM-menetelmät voidaan jakaa yhden säteen pyyhkäisytekniikoihin ja monisäteen skannaustekniikoihin.
Yksisäteinen skannaustekniikka mahdollistaa hermokudoksen nopean läpikäynnin suurella näkökentällä (FOV)
Kun MPM:ää käytetään neuronien kuvaamiseen, satunnaisskannaus – toisin sanoen lasersäde skannataan nopeasti missä tahansa valitussa pisteessä koko näkökentässä – voi skannata vain kiinnostuksen kohteena olevia hermosoluja, mikä paitsi välttää merkitsemättömien hermosäikeiden skannaamisen. optimoida myös lasersäteen skannausaika. Random-access-pyyhkäisy (kuva 1) voidaan saada aikaan akusto-optisella deflektorilla (AOD), joka toimii liittämällä radiotaajuisella signaalilla varustettu pietsosähköinen muunnin sopivaan kiteeseen. Tuloksena olevat akustiset aallot aiheuttavat jaksollisen taitekerroinhilan. Diffraktio tapahtuu, kun lasersäde kulkee hilan läpi. Ääniaallon intensiteettiä ja taajuutta voidaan säätää radiotaajuisella sähkösignaalilla muuttamaan taipuneen valon intensiteettiä ja suuntaa niin, että yksiulotteinen vaakasuuntainen mielivaltainen pisteskannaus voidaan toteuttaa käyttämällä yhtä AOD:ta ja 3D voidaan toteuttaa käyttämällä AOD-paria yhdistettynä muihin aksiaalisiin skannaustekniikoihin hajasaantiskannaukseen. Tämä tekniikka on kuitenkin erittäin herkkä näytteen liikkeelle ja altis liikeartefakteille. Tällä hetkellä nopeaa rasteriskannausta eli progressiivista skannausta FOV:ssa käytetään laajalti, koska algoritmi pystyy helposti ratkaisemaan liikeartefaktit.
AOD-pohjainen kaksifotonikuvaus neokortikaalisista L2/3-hermosoluista in vivo[2]
On monia tapoja toteuttaa nopea rasteriskannaus käyttämällä värinäpeiliä nopeaan 2D-skannaukseen, yhdistämällä värisevä peili ja säädettävä sähkölinssi nopeaan 3D-skannaukseen, mutta säädettävä sähkölinssi ei pysty tarkentamaan nopeasti aksiaalisuunnassa rajoitusten vuoksi. mekaaninen inertia Kuvanopeuteen vaikuttava kytkentä voidaan nyt korvata spatial light modulatorilla (SLM).
Etätarkennus on myös keino saavuttaa 3D-kuvaus, kuten kuvassa 2. LSU-moduulissa skannaava galvanometri skannaa vaakasuunnassa ja ASU-moduuli sisältää objektiivin L1 ja peilin M, ja aksiaalinen skannaus toteutetaan säätämällä. M:n sijainti. Tämä tekniikka ei voi ainoastaan korjata pääobjektiivin L2 aiheuttamaa optista poikkeamaa, vaan mahdollistaa myös nopean aksiaalisen skannauksen. Lisää hermosolukuvausta varten FOV:ta voidaan suurentaa säätämällä mikroskoopin objektiivilinssin rakennetta, mutta suurella NA:lla ja suurella FOV:lla varustettu objektiivi on yleensä raskas eikä voi liikkua nopeasti nopeaa aksiaaliskannausta varten, joten suuret FOV-järjestelmät luottavat telefocus-järjestelmään. , SLM ja säädettävät moottoroidut linssit.
Kaaviokaavio etätarkennettavasta kahden fotonin kuvantamisjärjestelmästä[3] Monisäteinen skannaustekniikka voi kuvata samanaikaisesti hermosolukudoksen eri asentoja
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm:n etäisyydellä toisistaan) kuvantamispaikat (kuvat 3C, D); vierekkäisillä alueilla se käyttää yleensä kuvantamiseen useita yhden objektiivin linssin säteitä (kuvat 3E, F). Monisädepyyhkäisytekniikassa on kiinnitettävä erityistä huomiota virityssäteiden väliseen ylikuulumisongelmaan, joka voidaan ratkaista valolähteen jälkeisellä erottelumenetelmällä tai aika-avaruusmultipleksointimenetelmällä. Post-hoc valonlähteiden erotusmenetelmä viittaa algoritmien käyttöön säteiden erottamiseksi ylikuulumisen poistamiseksi; aika-avaruusmultipleksointimenetelmällä tarkoitetaan useiden virityssäteiden samanaikaista käyttöä, jolloin kunkin säteen pulssit viivästyvät ajallisesti, jolloin eri säteiden virittämät yksittäiset säteet voidaan väliaikaisesti erottaa toisistaan. fluoresoiva signaali. Lisää neuroneja voidaan kuvata ottamalla käyttöön enemmän säteitä, mutta useat säteet lisäävät fluoresenssin vaimenemisajan päällekkäisyyttä, mikä rajoittaa kykyä erottaa signaalilähteet; ja multipleksoinnilla on negatiivinen vaikutus elektronisten laitteiden työnopeuteen. Korkeat vaatimukset; suuri määrä säteitä vaatii myös suuremman lasertehon ylläpitääkseen yhden säteen likimääräisen signaali-kohinasuhteen, mikä voi helposti johtaa kudosvaurioihin.
Suuren alueen kuvantamistekniikka
Viime vuosina erilaisten MPM-teknologioiden kehitys on laajentanut hermokudoksen kuvantamisen alaa, mikä on mahdollistanut useiden hermosolujen kuvaamisen syvällä aivoissa nopeammin, mikä on edistänyt suuresti neurotieteen tutkimusta ja auttanut meitä saamaan selkeämmän ymmärryksen. aivojen toiminnasta.
