Laserpyyhkäisevän monifotonimikroskoopin edut parantuneet
Laserpyyhkäisymonifotonimikroskooppi on merkittävä parannus optisessa mikroskopiassa, lähinnä kykyyn tarkkailla elävien ja kiinnittyneiden solujen ja kudosten syvärakennetta ja saada selkeitä ja teräviä monikerroksisia Z-tasorakenteita eli optisia viipaleita, joista näytteestä voidaan rakentaa kolmiulotteinen kiinteä rakenne. Konfokaalimikroskopia käyttää laservalonlähdettä, jota laajennetaan täyttämään objektiivin koko takapolttotaso, ja sitten se kulkee objektiivin linssijärjestelmän läpi suppenemaan hyvin pieniksi täpliksi näytteen polttotasolla. Objektiivin numeerisesta aukosta riippuen kirkkaan valaistuspisteen halkaisija on noin 0,25 ~ 0,8 μm ja syvyys noin 0,5 ~ 1,5 μm. Konfokaalipisteen koon määräävät mikroskoopin rakenne, laserin aallonpituus, objektiivin ominaisuudet, skannausyksikön tila-asetus ja näytteen luonne. Kenttämikroskoopeilla on laaja valaistusalue ja valaistuksen syvyys, kun taas konfokaalimikroskoopit keskittävät valaistuksen yhteen polttopisteeseen polttotasolla. Konfokaalimikroskoopin perusetu on kyky tehdä ohuita optisia leikkeitä paksuista fluoresoivista näytteistä (jopa 50 μm tai enemmän), joiden leikkauspaksuus on noin 0,5–1,5 μm. Sarja optisia leikkauskuvia voidaan saada liikuttamalla näytettä ylös ja alas mikroskoopin Z-akselin askelmoottorilla. Kuvainformaation hankintaa ohjataan ensimmäisessä tasossa, eivätkä näytteen muista kohdista lähetetyt signaalit häiritse sitä. Kun taustafluoresenssin vaikutukset on poistettu ja signaali-kohinasuhdetta on lisätty, konfokaalisen kuvan kontrasti ja tarkkuus paranevat merkittävästi verrattuna tavanomaisiin kentällä valaistuihin fluoresenssikuviin. Monissa näytteissä monet monimutkaiset rakenneosat kietoutuvat yhteen muodostaen monimutkaisia järjestelmiä, mutta kun optisia osia on saatu tarpeeksi, voimme rekonstruoida ne kolmiulotteisesti ohjelmiston avulla. Tätä kokeellista menetelmää on käytetty laajasti biologisessa tutkimuksessa solujen tai kudosten välisten monimutkaisten rakenteellisten ja toiminnallisten suhteiden selvittämiseen.
