Laserkonfokaalimikroskopia - Ominaisuudet ja sovellukset
Laserpyyhkäisykonfokaalinen mikroskopia (LSCM) on mikroskoopin tyyppi, joka perustuu konjugaattifokusointitekniikkaan, eli laservalonlähde, mitattava näyte ja ilmaisin ovat kaikki konjugaattiasennossa keskenään.
Perusteellista
Yleismikroskoopissa havainnointikuvataso eristetään viereisestä aksiaalisesta tasosta kohdistamalla objektiivin polttotaso ilmaisimen kanssa, kun taas konfokaalimikroskoopissa näytteen valaisemiseen käytetään diffraktiorajoitettua valopistettä ja A. pinholea käytetään kerätyssä valopolussa valopisteen konjugaattikohdassa hajavalon suodattamiseksi tämän eristysvaikutelman luomiseksi ja siten resoluution parantamiseksi.
Kuvausominaisuudet
Optinen osaskannauskuvaus
Toinen laserskannauskonfokaalimikroskopian ominaisuus on, että se on skannaava kuvantamistekniikka. Perinteinen laajakenttävalaistustekniikka valaisee koko näytteen, joten kuva voidaan ottaa suoraan paljaalla silmällä tai ilmaisimella, mutta LSCM käyttää sädettä tai Useita fokusoituja säteitä kulkee näytteen läpi skannaukseen ja kuvaamiseen. Tuloksena olevaa kuvaa kutsutaan optiseksi osaksi. Seuraavassa on esitetty ero perinteisen laajakentän valaistusmenetelmän ja laserkeilaavan konfokaalisen valaistusmenetelmän välillä.
Siksi nykyaikaisen konfokaalimikroskoopin todellinen työskentelytapa on alla olevassa kuvassa esitetty. Laserin lähettämä viritysvalo kulkee dikroisen peilin läpi ja skannataan näytteen x- ja y-suunnassa galvanometriparin läpi. Näytteen viritys (tai heijastus) on Valo tulee PMT-ilmaisimeen neulanreiän kautta ja tallennetaan, ja tallennettu skannattu kuva rekonstruoidaan tietokoneella todellisen näytekuvan rekonstruoimiseksi.
Luo "z-stack" -kuvia eri polttotasoilla
Vain konjugoidusta näytekerroksesta takaisin heijastuva valo voi kulkea keräysvalopolun pienen reiän läpi, ja jäljelle jääneet epäolennaiset näytekerroksen heijastukset estetään pienellä reiällä. Tämä voi johtaa merkittäviin resoluution parannuksiin. Saman paksun näytteen moniulotteisen fluoresenssimikroskopian ja konfokaalimikroskopian rinnakkainen vertailu. Kun sarja kuvia otetaan eri polttotasoilla, voidaan luoda kuvia, joita kutsutaan yleisesti "z-pinoiksi", jotka kuvaavat konfokaalimikroskopian tarjoamia resoluutio- ja kontrastiparannuksia ja näiden vahvistusten taustalla olevia syitä. Voidaan nähdä, että pinon yläosassa olevaa kuvaa tarkasteltaessa kuvantamistaso kudoksen yläpuolella paljastaa fluoresenssikuvassa suuren määrän hajavaloa, kun taas konfokaalinen mikroskopiakuva näyttää mustalta. Tämä aksiaalisen PSF:n väheneminen johtaa suoraan erotuskykyeroon, joka havaitaan optisessa rajapinnassa z-pinon keskellä.
Resoluutio on huomattavasti parempi verrattuna laajakenttävalaistukseen
Fluoresenssimikroskopiassa yhdestä pisteestä säteilevää valon intensiteettiä kuvaa pistehajautusfunktio (PSF), ja sen kuvio on Airy kiekko. Fluoresenssijärjestelmän resoluutiota voidaan kuvata Airy-kiekon säteellä, jota voidaan kuvata Objektiivin numeerinen aukko ja viritysvalon aallonpituus määräävät
