Laserkonfokaalimikroskoopin ominaisuudet ja sovellukset
Kun normaalimikroskoopissa havainnon kuvataso eristetään viereisistä aksiaalisista tasoista limittämällä objektiivin polttotaso ilmaisimen kanssa, niin konfokaalimikroskoopissa tämä eristäminen saadaan aikaan valaisemalla näytettä diffraktiorajoitetulla pisteellä. valoa ja suodattaa hajavaloa käyttämällä neulanreikää kerätyn valon reitillä tämän valopisteen konjugaattikohdassa tämän eristyksen saavuttamiseksi ja siten resoluution parantamiseksi.
Vain konjugaattinäytekerroksesta takaisin heijastuva valo voi kulkea keräysvalopolun neulanreiän läpi, kun taas neulanreikä estää loput epäolennaisista näytekerroksen heijastuksista. Tämä lisää merkittävästi resoluutiota. Alla on esitetty saman paksun näytteen moniulotteisen fluoresenssimikroskopian ja konfokaalimikroskopian rinnakkainen vertailu. Kun sarja kuvia otetaan eri polttotasoilla, syntyy kuva, jota kutsutaan yleisesti "z-pinoksi", joka näyttää konfokaalimikroskopian tarjoaman resoluution ja kontrastin vahvistuksen sekä näiden vahvistusten taustalla olevat syyt. Voidaan nähdä, että tarkasteltaessa pinon yläosassa olevaa kuvaa, jossa kuvaustaso on kudoksen yläpuolella, paljastuu suuri määrä hajavaloa fluoresenssikuvassa, kun taas konfokaalimikroskoopin kuva näyttää mustalta. Tämä PSF:n väheneminen aksiaalisessa suunnassa myötävaikuttaa suoraan erottelukykyyn, joka havaitaan optisessa rajapinnassa z-pinon keskellä.
Optinen slice-skannauskuvaus
Toinen laserskannauskonfokaalimikroskopian ominaisuus on, että se on skannaava kuvantamistekniikka. Perinteiset laajakenttävalaistustekniikat valaisevat koko näytteen niin, että kuva voidaan ottaa suoraan paljaalla silmällä tai ilmaisimella, mutta LSCM käyttää yhtä tai useampaa fokusoitua valonsädettä näytteen läpi skannaamiseen, joten tuloksena olevaa kuvaa kutsutaan ns. optinen viipale, kuten seuraavassa kaaviossa näkyy. Perinteisen laajakenttävalaistuksen ja laserkeilauksen konfokaalisen valaistuksen välinen ero on esitetty alla.
Siksi alla olevassa kuvassa on esitetty nykyaikaisen konfokaalimikroskopian käytännöllinen tapa. Laserista tuleva viritysvalo johdetaan dikroisen peilin läpi ja skannataan galvanometripeiliparin läpi näytteen x- ja y-suunnassa, ja näytteen viritys (tai heijastus) kulkee neulanreiän kautta PMT:hen. tallennettava ilmaisin, ja tallennettu skannattu kuva rekonstruoidaan tietokoneella todellisen kuvan tuottamiseksi näytteestä.
