Konfokaalista fluoresenssimikroskopiaa koskeva tieto
Konfokaalisen fluoresenssimikroskopian perusperiaate on käyttää pistevalonlähdettä näytteen säteilyttämiseen, jolloin muodostuu tarkasti määritelty pieni täplä polttotasolle. Objektiivin linssi kerää pisteen lähettämän fluoresenssin säteilytyksen jälkeen ja lähettää takaisin kaksisuuntaisesta väripeilistä koostuvaan spektrofotometriin alkuperäistä säteilytysreittiä pitkin. Spektrofotometri lähettää fluoresenssin suoraan detektoriin. Valonlähteen ja ilmaisimen edessä on kaksi neulanreikää, joita kutsutaan vastaavasti valaistuksen neulanreikiksi ja tunnistusneulanreikiksi. Näiden kahden geometriset mitat ovat yhdenmukaiset, noin 100-200nm; Polttotason valopisteeseen verrattuna nämä kaksi ovat konjugoituja, mikä tarkoittaa, että valopiste kulkee linssien sarjan läpi ja voi viime kädessä tarkentaa sekä valaistuksen neulanreikään että tunnistusreikään samanaikaisesti. Tällä tavalla polttotasosta tuleva valo voi konvergoida tunnistusreiän alueella, kun taas polttotason ylä- tai alapuolelta sironnut valo on estetty tunnistusreiän ulkopuolella, eikä sitä voida kuvata. Skannaamalla näytettä laserilla piste pisteeltä valomonistinputki saa neulanreiän havaitsemisen jälkeen myös vastaavan konfokaalikuvan valosta piste pisteeltä, joka muunnetaan digitaaliseksi signaaliksi ja lähetetään tietokoneelle. Lopuksi näytölle syntetisoidaan selkeä konfokaalinen kuva koko polttotasosta.
Jokainen polttotasokuva on itse asiassa näytteen optinen poikkileikkaus, jolla on aina tietty paksuus, joka tunnetaan myös optisena ohuena leikkauksena. Koska valon intensiteetti polttopisteessä on paljon suurempi kuin ei-fokusoivassa pisteessä, ja ei-fokusoiva tason valo suodatetaan pois neulanreikien avulla, konfokaalijärjestelmän syväterävyys on suunnilleen nolla. Pyyhkäisemällä Z-akselin suunnassa voidaan saavuttaa optinen tomografia, joka muodostaa kaksiulotteisen optisen viipaleen havaitun näytteen polttopisteeseen. Yhdistämällä XY-tason (fokusointitaso) skannauksen Z-akselin (optisen akselin) skannaukseen, näytteestä saadaan kolmiulotteinen kuva keräämällä jatkuvia kerroksia kaksiulotteisia kuvia ja käsittelemällä niitä erikoistuneella tietokoneohjelmistolla.
Havaitsemisneulanreikä ja valonlähteen neulanreikä fokusoidaan aina samaan pisteeseen, joten tarkennustason ulkopuolella virittynyt fluoresenssi ei pääse tunnistusreikään.
Laserkonfokaalimikroskopian toimintaperiaatteen yksinkertainen ilmaus on, että se käyttää laseria valonlähteenä ja lisää siihen laserskannauslaitteen ja konjugaattitarkennuslaitteen perinteisen fluoresenssimikroskopian pohjalta. Se on tietokoneen ohjaama järjestelmä digitaalisten kuvien hankintaa ja käsittelyä varten.
