Tietoa kaksi{0}}fotonifluoresenssimikroskopiasta
Kahden{0}}fotonivirityksen perusperiaate on, että suurella fotonitiheydellä fluoresoivat molekyylit voivat samanaikaisesti absorboida kaksi pitkän aallonpituuden fotonia ja lähettää lyhyemmän aallonpituisen fotonin lyhyen -ns. viritetyn tilan elinajan jälkeen. Vaikutus on sama kuin käytettäessä fotonia puolet pitkän aallonpituuden aallonpituudesta fluoresoivien molekyylien virittämiseen. Kahden fotonin viritys vaatii suurta fotonitiheyttä, ja solujen vaurioitumisen välttämiseksi kaksi-fotonimikroskopiassa käytetään korkean-energiatilan-lukittuja pulssilasereita. Tämän laserin lähettämällä laserilla on korkea huippuenergia ja alhainen keskimääräinen energia, pulssin leveys on vain 100 femtosekuntia ja taajuus jopa 80-100 megahertsiä. Käytettäessä suuren numeerisen aukon objektiivilinssiä pulssilaserin fotonien tarkentamiseen, fotonitiheys objektiivilinssin polttopisteessä on suurin, ja kahden{11}}fotonin viritys tapahtuu vain objektiivilinssin polttopisteessä. Siksi kaksi{13}}fotonimikroskooppi ei vaadi konfokaalista neulanreikää, mikä parantaa fluoresenssin havaitsemisen tehokkuutta.
Yleisissä fluoresenssiilmiöissä viritysvalon alhaisesta fotonitiheydestä johtuen fluoresoiva molekyyli voi absorboida vain yhden fotonin kerrallaan ja lähettää sitten toisen fluoresoivan fotonin säteilysiirtymän kautta, joka tunnetaan yksittäisfotonifluoresenssina. Fluoresenssiviritysprosesseissa, joissa käytetään lasereita valonlähteinä, voi esiintyä kahden-fotoni- tai jopa monifotonifluoresenssiilmiöitä. Tässä tapauksessa käytetyllä viritysvalonlähteellä on korkea intensiteetti ja fotonitiheys, joka täyttää fluoresoivien molekyylien vaatimuksen absorboida kaksi fotonia samanaikaisesti. Yleislaseria käytettäessä viritysvalonlähteenä fotonitiheys ei vieläkään riitä tuottamaan kahden-fotonin absorptioilmiötä. Tyypillisesti käytetään femtosekuntipulssilasereita, joiden hetkellinen teho saavuttaa megawattitason. Siksi kahden-fotonin fluoresenssin aallonpituus on lyhyempi kuin viritysvalon aallonpituus, mikä vastaa puolen viritysaallonpituuden herätteen tuottamaa vaikutusta.
