Johdatus fluoresenssimikroskopiaan

Johdatus fluoresenssimikroskopiaan

Fluoresenssimikroskopian tarkoituksena on säteilyttää fluoreseiinilla värjätty kohde lyhyen aallonpituuden valolla niin, että se viritetään tuottamaan pitkän aallonpituuden fluoresenssi, ja sitten tarkkaillaan. Fluoresenssimikroskoopissa tietyn aallonpituuden viritysvalo on valittava näytteen valaistusvalosta fluoresenssin muodostamiseksi, minkä jälkeen fluoresenssi on erotettava viritysvalon ja fluoresenssin sekavalosta havainnointia varten. Siksi suodatinjärjestelmällä on erittäin tärkeä rooli tietyn aallonpituuden valinnassa. Fluoresenssimikroskooppeja käytetään laajalti biologiassa, lääketieteessä ja muilla aloilla.

1. Fluoresenssimikroskoopin pääkomponentit:

(A) Valonlähde: Valonlähde säteilee valoa eri aallonpituuksilla (ultravioletista infrapunaan). the

(B) Virityssuodattimen valonlähde: tietyn aallonpituuden valon läpi, joka voi saada näytteen tuottamaan fluoresenssia, samalla kun se estää valon, joka ei ole hyödytöntä herättämään fluoresenssia. the

(C) Fluoresoivat näytteet: yleensä värjätty fluoresoivilla pigmenteillä. the

(D) Estosuodatin: estä viritysvalo, jota näyte ei absorboi, ja lähetä selektiivisesti fluoresenssia, ja jotkin aallonpituudet välittyvät selektiivisesti fluoresenssissa.

sitä
2. Fluoresenssimikroskooppien luokitus:

Fluoresenssimikroskoopit jaetaan yleensä kahteen tyyppiin: transmissio ja epiemissio:

a. Lähetystyyppi: viritysvalo tulee tarkastettavan kohteen pohjasta ja kondensaattori on tummakenttäkondensaattori, jolloin viritysvalo ei pääse objektiiviin, vaan fluoresenssi tulee objektiivin linssiin. Se on kirkas pienillä suurennoksilla, mutta tumma suurilla suurennoksilla. Öljyupotuksella ja keskittämisellä on vaikea toimia. Valaistusalueen määrittäminen on erityisen vaikeaa pienillä suurennoksilla, mutta sillä voi saada hyvin tumman näkökentän taustan. Lähetystyyppiä ei käytetä ei-läpinäkyville objekteille. the

b. Epi-tyyppi: Vaihteistotyyppi on tällä hetkellä lähes eliminoitu. Suurin osa uusista fluoresenssimikroskoopeista on epi-tyyppisiä. Valonlähde tulee tarkastettavan kohteen ylhäältä ja optisella polulla on säteenjakaja, joten se soveltuu tarkastettavaksi sekä läpinäkyville että läpinäkymättömille kohteille. Koska objektiivi toimii kondensaattorilinssinä, se ei ole vain helppokäyttöinen, vaan sillä voidaan myös saavuttaa tasainen valaistus koko näkökentässä pienestä suurennokseen. the

sitä
3. Fluoroskopiaa koskevat varotoimet

a. Pitkäaikainen viritysvalon säteilytys aiheuttaa fluoresenssin vaimenemisen ja sammumisen, joten lyhennä havainnointiaikaa mahdollisimman paljon ja käytä ohjauslevyä peittämään viritysvalo, kun et tilapäisesti tarkkaile. the

b. Kun tarkkailet öljyimmersiolinssillä, käytä "ei-fluoresoivaa öljyä". the

c. Fluoresenssi on lähes aina heikkoa ja se tulisi suorittaa pimeässä huoneessa. the

d. On parasta asentaa jännitteenvakain virtalähteeseen, muuten epävakaa jännite ei vain lyhennä elohopealampun käyttöikää, vaan vaikuttaa myös mikroskoopin tarkastuksen vaikutukseen. the

sitä
4. Fluoresenssimikroskoopin käyttö

1. Fluoresenssimikroskoopin näytteiden valmistusvaatimukset

a. Lasinen liukumäki

Lasilevyn paksuuden tulee olla 0,8–1,2 mm. Liian paksu objektilasi imee toisaalta enemmän valoa, toisaalta viritysvaloa ei voida keskittyä näytteeseen. Diojen on oltava sileitä, tasapaksuisia ja vailla ilmeistä autofluoresenssia. Joskus käytetään kvartsilasilevyjä. the

b. Peitelasi

Peitelasin paksuus on noin 0,17 mm, sileä. Viritysvalon vahvistamiseksi voidaan käyttää myös kuivaa peitelasia, joka on erityinen peitelasi, joka on päällystetty useilla ainekerroksilla (kuten magnesiumfluoridilla), joilla on erilaisia ​​häiriövaikutuksia eri aallonpituuksille valolle, mikä voi tehdä fluoresenssi sujuu ongelmitta. Viritysvalo johdetaan läpi, ja heijastunut viritysvalo virittää näytteen. the

c. Näyte

Kudosviipaleet tai muut näytteet eivät saa olla liian paksuja. Jos se on liian paksu, suurin osa viritysvalosta kuluu näytteen alaosassa, kun taas objektiivin suoraan havaitsemaa yläosaa ei voida täysin virittää. Lisäksi solujen päällekkäisyys tai epäpuhtaudet peittävät, mikä vaikuttaa tuomioon. the

d. Asennusaine

Glyseriiniä käytetään yleisesti kiinnitysaineena, joka ei saa olla autofluoresenssia, väritöntä ja läpinäkyvää, ja fluoresenssin kirkkaus on kirkkaampi pH:ssa 8.{1}}.5, eikä se ole helppo haalistua nopeasti. Sen vuoksi kiinnitysaineena käytetään yleisesti yhtä suurta seosta glyserolia ja 0,5 mol/l karbonaattipuskuriliuosta, jonka pH on 9.0 - 9,5. the

e. peiliöljy

Yleensä immersioöljyä on käytettävä, kun näytteitä tarkkaillaan tummakentän fluoresenssimikroskoopeilla ja öljyimmersio-immersioobjektiiveilla. Paras on käyttää erikoista ei-fluoresoivaa peiliöljyä, joka voidaan myös korvata yllä mainitulla glyseriinillä, ja myös nestemäistä parafiinia voidaan käyttää, mutta taitekerroin on alhainen, mikä vaikuttaa hieman kuvanlaatuun.