Fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen optisen mikroskoopin erot ja ominaisuudet
Fluoresenssimikroskooppi eroaa tavallisesta optisesta mikroskoopista. Se ei tarkkaile näytettä tavallisen valonlähteen valaistuksen kautta. Sen sijaan se käyttää tietyn aallonpituuden valoa (yleensä ultraviolettivaloa, siniviolettia valoa) virittääkseen näytteessä olevan fluoresoivan materiaalin mikroskoopin alla, jolloin se emittoi fluoresenssia. Siksi fluoresenssimikroskoopin valonlähde ei toimi suorana valaistuksena, vaan energialähteenä, joka virittää näytteen sisäisen fluoresoivan materiaalin. Syy, miksi voimme tarkkailla näytettä, ei johdu valonlähteen valaistuksesta, vaan fluoresenssiilmiöstä, jonka aiheuttaa näytteessä oleva fluoresoiva materiaali, joka absorboi viritetyn valoenergian. Voidaan nähdä, että fluoresenssimikroskoopin pääominaisuus on, että sen valonlähde pystyy tuottamaan suuren määrän viritysvaloa tietyllä aallonpituusalueella, jolloin tutkittavassa näytteessä olevat fluoresoivat aineet voivat saada tarvittavan viritysvalon intensiteetin. Samanaikaisesti fluoresenssimikroskoopeissa on oltava vastaavat suodatinjärjestelmät. Fluoresenssimikroskopia on välttämätön työkalu edistyneelle fluoresenssihistokemialle. Se koostuu ultrakorkeapaineisesta valonlähteestä, suodatinjärjestelmästä (mukaan lukien viritys- ja vaimennussuodatinlevyt), optisesta järjestelmästä ja valokuvausjärjestelmästä. Se käyttää tietyn aallonpituuden valoa näytteen virittämiseen fluoresenssiin.
1. Fluoresenssin virittämistavat: Valon aallonpituusalueen mukaan se jaetaan kahteen tyyppiin: UV-viritysmenetelmä (käyttämällä ultraviolettivalaistusmenetelmää) ja BV-viritysmenetelmä (käyttäen siniviolettia valoa). UV-viritysmenetelmässä käytetään viritykseen alle 400 nm:n lähes ultraviolettivaloa. Tässä menetelmässä ei ole näkyvää viritysvaloa, joten havaittu fluoresenssi osoittaa väriaineen luontaisen fluoresenssin, jolloin on helppo erottaa näytteen spesifinen fluoresenssi taustakudoksen autofluoresenssista.
2. BV-viritysmenetelmä: viritys ultraviolettisäteilystä siniseen valoon, jonka keskipiste on 404 nm ja 434 nm. Tämä menetelmä käyttää sinistä valoa näytteen valaisemiseen, joten fluoresenssihavaintojärjestelmän rajasuodattimen on käytettävä suodatinta, joka voi estää sinisen valon kokonaan ja läpäistä vaaditun vihreän ja keltaisen fluoresenssin. Fluoresoivissa vasta-ainemenetelmissä käytetyt fluoresoivat värit. Viritysvalon maksimiabsorptioaallonpituus ja fluoresenssin maksimiemissioaallonpituus ovat suhteellisen lähellä toisiaan, joten BV-viritysmenetelmässä käytettävän suodattimen tulee käyttää terävää katkaisusuodatinta. Tällä menetelmällä voidaan käyttää sinistä valoa viritysvalona, jolloin fluoresoivien pigmenttien absorptiotehokkuus on korkeampi ja saadaan kirkkaampia kuvia. Haittapuolena on, että alle 500 nm:n fluoresenssia ei voida nähdä, kun taas yli 500 nm:n fluoresenssi saa koko kuvan näyttämään keltaiselta. Fluoresoivassa vasta-ainemenetelmässä fluoresoivan väriaineen spesifisyys arvioidaan enimmäkseen sen ainutlaatuisen värin perusteella. Siksi kun puhutaan hienovaraisesta spesifisyydestä, yllä mainituilla BV-herätysmenetelmän puutteilla on usein suuri vaikutus.
