Ero fluoresenssimikroskoopin ja normaalimikroskoopin välillä
1. Katso valaistusmenetelmää
Fluoresenssimikroskoopin valaistusmenetelmä on yleensä epi-tyyppinen, eli valonlähde sijoitetaan testinäytteelle objektiivin läpi.
2. Katso resoluutiota
Fluoresenssimikroskoopit käyttävät valonlähteenä ultraviolettivaloa, jonka aallonpituus on suhteellisen lyhyt, mutta resoluutio on korkeampi kuin tavallisten optisten mikroskooppien.
3, ero suodattimessa
Fluoresenssimikroskoopissa käytetään kahta erityistä suodatinta, joita käytetään valonlähteen edessä suodattamaan näkyvää valoa ja joita käytetään objektiivin ja okulaarin välissä suodattamaan ultraviolettivaloa, joka voi suojata ihmisen silmiä.
Fluoresenssimikroskooppi on myös eräänlainen optinen mikroskooppi, pääasiassa siksi, että fluoresenssimikroskoopin virittämä aallonpituus on lyhyt, joten tämä johtaa eroon fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen mikroskoopin rakenteessa ja käytössä. Useimmilla fluoresenssimikroskoopeilla on hyvä toiminto heikon valon sieppaamisessa. , joten erittäin heikon fluoresenssin alla sen kuvantamiskyky on myös hyvä. Yhdessä fluoresenssimikroskopian jatkuvan parantamisen kanssa viime vuosina, melu on myös vähentynyt huomattavasti. Siksi fluoresenssimikroskooppeja käytetään yhä enemmän.
Kaksifotonisen fluoresenssimikroskopian tuntemus
Kaksifotoniviritteen perusperiaate on: korkean fotonitiheyden tapauksessa fluoresoivat molekyylit voivat absorboida kaksi pitkäaaltoista fotonia samanaikaisesti ja hyvin lyhyen ns. viritetyn tilan elinajan jälkeen emittoi lyhytaaltoisen fotonin. ; vaikutus on sama kuin käytettäessä fotonia, jonka aallonpituus on puolet pitkästä aallonpituudesta, fluoresoivan molekyylin virittämiseen. Kaksifotoniviritys vaatii suurta fotonitiheyttä, ja jotta solut eivät vahingoittuisi, kaksifotonimikroskoopissa käytetään korkean energian tilalukittuja pulssilasereita. Tämä laser lähettää laservaloa korkealla huippuenergialla ja alhaisella keskienergialla, pulssin leveydellä vain 100 femtosekuntia ja taajuudella 80-100 MHz. Kun suuren numeerisen aukon objektiivilinssiä käytetään pulssilaserin fotonien tarkentamiseen, fotonitiheys objektiivin polttopisteessä on suurin ja kahden fotonin viritys tapahtuu vain objektiivin polttopisteessä, joten kaksifotonimikroskooppi ei tarvitse konfokaalista neulanreikää, mikä parantaa fluoresenssitunnistuksen tehokkuutta.
Yleisessä fluoresenssiilmiössä viritysvalon alhaisesta fotonitiheydestä johtuen fluoresoiva molekyyli voi absorboida vain yhden fotonin samanaikaisesti ja lähettää sitten fluoresoivan fotonin säteilysiirtymän kautta, jota kutsutaan yksifotonifluoresenssiksi. Fluoresenssiviritysprosessissa laserin valonlähteenä voi esiintyä kahden fotonin tai jopa usean fotonin fluoresenssiilmiötä. Tällä hetkellä käytetyn viritysvalonlähteen intensiteetti on korkea ja fotonitiheys täyttää vaatimuksen, jonka mukaan fluoresoiva molekyyli absorboi kaksi fotonia samanaikaisesti. Yleislaseria käytettäessä viritysvalonlähteenä fotonitiheys ei vieläkään riitä tuottamaan kahden fotonin absorptiota. Yleensä käytetään femtosekunnin pulssilaseria, jonka hetkellinen teho voi olla megawatin luokkaa. Siksi kahden fotonin fluoresenssin aallonpituus on lyhyempi kuin viritysvalon aallonpituus, mikä vastaa puoliviritteen aallonpituuden herätteen tuottamaa vaikutusta.
Kahden fotonin fluoresenssimikroskopialla on monia etuja:
1) Sironta vaikuttaa vähemmän pitkän aallonpituuden valoon kuin lyhytaaltoiseen valoon, ja se voi tunkeutua helposti näytteen läpi;
2) Polttotason ulkopuolella olevia fluoresoivia molekyylejä ei viritetä, jotta enemmän viritysvaloa pääsee polttotasolle, jotta viritysvalo voi tunkeutua syvemmille näytteille;
3) Pitkän aallonpituinen lähi-infrapunavalo on vähemmän myrkyllistä soluille kuin lyhytaaltoinen valo;
4) Kun näytteitä tarkastellaan kaksifotonimikroskoopilla, valovalkaisu ja fototoksisuus ovat läsnä vain polttotasossa. Siksi kaksifotonimikroskooppi sopii paremmin paksujen näytteiden katseluun kuin yksifotonimikroskooppi, elävien solujen katseluun tai kiinteän pisteen valovalkaisukokeiden suorittamiseen.
Konfokaalifluoresenssimikroskopian tuntemus
Konfokaalifluoresenssimikroskopian perusperiaate: käyttämällä pistevalonlähdettä näytteen valaisemiseen, polttotasolle muodostuu pieni valopiste, jolla on hyvin määritellyt ääriviivat. koostuu säteenjakajasta. Säteenjakaja lähettää fluoresenssin suoraan ilmaisimeen. Valonlähteen ja ilmaisimen edessä on neulanreikä, joita kutsutaan vastaavasti valaistuksen neulanreikiksi ja ilmaisimen reikäksi. Näiden kahden geometriset mitat ovat samat, noin 100-200 nm; polttotason valopisteeseen nähden nämä kaksi ovat konjugoituja, eli valopiste kulkee linssien sarjan läpi ja lopulta voidaan tarkentaa valaistusneulanreikään ja tunnistusneulanreikään samanaikaisesti. Tällä tavalla polttotasosta tuleva valo voidaan keskittää tunnistusreiän alueelle, kun taas polttotason ylhäältä tai alapuolelta sironnut valo on estetty havainnointireiästä eikä sitä voida kuvata. Näyte skannataan laserilla pisteeltä, ja valomonistinputki saa neulanreiän havaitsemisen jälkeen myös vastaavan valon konfokaalisen kuvan piste pisteeltä, joka muunnetaan digitaaliseksi signaaliksi ja lähetetään tietokoneelle ja lopuksi aggregoidaan näytön selkeäksi konfokaaliseksi kuvaksi koko polttotasosta. .
Jokainen polttotason kuva on itse asiassa näytteen optinen poikkileikkaus, ja tällä optisella poikkileikkauksella on aina tietty paksuus, joka tunnetaan myös nimellä optinen viipale. Koska valon intensiteetti polttopisteessä on paljon suurempi kuin ei-fokusoivassa pisteessä ja ei-fokusoiva tason valo suodatetaan neulanreiällä, konfokaalijärjestelmän syväterävyys on suunnilleen nolla ja skannaus pitkin Z-akselilla voidaan toteuttaa optinen tomografia, joka muodostaa kaksiulotteisen optisen leikkauksen näytteen fokusoidusta kohdasta. Yhdistämällä XY-tason (fokusointitaso) skannaus Z-akselin (optinen akseli) skannaukseen, keräämällä kaksiulotteisia kuvia peräkkäisistä kerroksista ja käsittelemällä erityisellä tietokoneohjelmistolla, saadaan näytteestä kolmiulotteinen kuva.
Toisin sanoen tunnistusneulanreikä ja valonlähteen neulanreikä on aina fokusoitu samaan pisteeseen, jolloin tarkennustason ulkopuolella virittynyt fluoresenssi ei pääse tunnistusreikään.
Konfokaalilaserin toimintaperiaatteen yksinkertainen ilmaus on se, että se käyttää valonlähteenä laseria ja perinteisen fluoresenssimikroskooppikuvauksen perusteella siihen on liitetty laserskannauslaite ja konjugaattitarkennuslaite sekä digitaalisen kuvan hankinta ja käsittely. järjestelmää ohjataan tietokoneella.
