Ero fluoresenssimikroskoopin ja normaalin mikroskoopin välillä
Yritin hiljattain tehdä hiiristä jäädytettyjä osia. Seuraavaksi käytän fluoresenssimikroskooppia nähdäkseni, onko injektoimani virus haluamallani aivoalueella. Jotkut fluoresenssimikroskopian perusperiaatteet on opittava lyhyesti, ja jaan ne täällä.
Fluoresenssimikroskoopit käyttävät ultraviolettivaloa valonlähteenä tarkastettavan kohteen valaisemiseen, jolloin kohde säteilee valoa, ja sitten tarkkaile kohdetta mikroskoopin alla. Sitä käytetään pääasiassa immunofluoresenssisoluihin. Se koostuu pääasiassa valonlähteestä, suodatinlevyjärjestelmästä ja optisesta järjestelmästä. Näytteen fluoresoiva kuva havaitaan okulaarin ja objektiivin suurennuksen kautta. Katsotaanpa eroa fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen optisen mikroskoopin välillä.
1. Katso valaistusmenetelmää
Fluoresenssimikroskoopin valaistusmenetelmänä on yleensä epi-valaistus, mikä tarkoittaa, että valonlähde sijoitetaan testinäytteeseen objektiivin läpi.
2. Katso resoluutio
Fluoresenssimikroskoopit käyttävät valonlähteenä ultraviolettivaloa, jonka aallonpituus on lyhyempi, mutta resoluutio suurempi kuin tavallisissa optisissa mikroskoopeissa.
3. Suodattimien erot
Fluoresenssimikroskoopit käyttävät kahta erityistä suodatinta, joista toista käytetään valonlähteen edessä suodattamaan näkyvää valoa ja toista objektiivin ja okulaarin välissä suodattamaan ultraviolettisäteet, jotka voivat suojata ihmisen silmiä.
Fluoresenssimikroskooppi on myös eräänlainen optinen mikroskooppi. Pääsyynä on se, että fluoresenssimikroskoopin virittämä aallonpituus on lyhyt, joten tämä johtaa eroon fluoresenssimikroskoopin ja tavallisen mikroskoopin rakenteessa ja käytössä. Useimmilla fluoresenssimikroskoopeilla on hyvä toiminto heikon valon sieppaamisessa. , joten sen kuvantamiskyky on hyvä myös erittäin heikon fluoresenssin alla. Yhdessä fluoresenssimikroskooppien jatkuvan parantamisen kanssa viime vuosina, melu on myös vähentynyt huomattavasti. Siksi fluoresenssimikroskooppeja käytetään yhä enemmän.
Tietoa kahden fotonin fluoresenssimikroskopiasta
Kaksifotoniviritteen perusperiaate on: korkean fotonitiheyden olosuhteissa fluoresoivat molekyylit voivat absorboida kaksi pitkän aallonpituista fotonia samanaikaisesti ja lyhyen ns. viritetyn tilan elinajan jälkeen emittoida lyhyemmän aallonpituuden fotonin. . Vaikutus on sama kuin käytettäessä fotonia, jonka aallonpituus on puolet pitkästä aallonpituudesta, fluoresoivien molekyylien virittämiseen. Kahden fotonin viritys vaatii korkean fotonitiheyden. Jotta solut eivät vahingoittuisi, kaksifotonimikroskoopit käyttävät korkean energian tilalukittuja pulssilasereita. Tämä laser lähettää laservaloa korkealla huippuenergialla ja alhaisella keskienergialla, pulssin leveydellä vain 100 femtosekuntia ja taajuudella 80-100 MHz. Käytettäessä suuren numeerisen aukon objektiivilinssiä pulssilaserin fotonien tarkentamiseen, fotonitiheys objektiivilinssin fokuskohdassa on suurin. Kaksifotoninen viritys tapahtuu vain objektiivin fokuskohdassa, joten kaksifotoninen mikroskooppi ei vaadi konfokaalista neulanreikää, mikä parantaa fluoresenssin havaitsemisen tehokkuutta.
Yleisessä fluoresenssiilmiössä viritysvalon alhaisesta fotonitiheydestä johtuen fluoresoiva molekyyli voi absorboida vain yhden fotonin samanaikaisesti ja sitten lähettää yhden fluoresenssifotonin säteilysiirtymän kautta. Tämä on yhden fotonin fluoresenssia. Fluoresenssiviritysprosessissa, jossa käytetään laseria valonlähteenä, voi esiintyä kahden fotonin tai jopa usean fotonin fluoresenssiilmiöitä. Tässä tapauksessa käytettävän viritysvalonlähteen intensiteetti on korkea ja fotonitiheys täyttää fluoresoivien molekyylien vaatimuksen absorboida kaksi fotonia samanaikaisesti. Käytettäessä tavallisia lasereita viritysvalonlähteinä fotonitiheys ei vieläkään riitä tuottamaan kahden fotonin absorptiota. Yleensä käytetään femtosekuntipulssilasereita, joiden hetkellinen teho voi saavuttaa megawattitason. Siksi kahden fotonin fluoresenssin aallonpituus on lyhyempi kuin viritysvalon aallonpituus, mikä vastaa puoliviritteen aallonpituuden herätteen tuottamaa vaikutusta.
