Erilaisten superresoluutiomikroskooppitekniikoiden vertailu
Perinteisessä valomikroskopiassa valon diffraktio rajoittaa kuvantamisen resoluution noin 250 nm:iin. Nykyään superresoluutiotekniikat voivat parantaa tätä yli 10-kertaisesti. Tämä tekniikka saavutetaan pääasiassa kolmella menetelmällä: yksimolekyylinen lokalisointimikroskopia, mukaan lukien valoherkkä lokalisaatiomikroskopia (PALM) ja stokastinen optinen rekonstruktiomikroskopia (STORM); strukturoitu valaistusmikroskopia (SIM); ja stimuloidun emissiovaimentimen mikroskopia (STED). Superresoluutiotekniikan valinta on asia, joka kiinnostaa kaikkia. "Valitettavasti ei ole olemassa yksinkertaisia periaatteita käytettävän menetelmän päättämiseksi", sanoo Mathew Stracy, tohtoritutkija Oxfordin yliopistosta, Iso-Britanniasta. "Jokaisella on omat hyvät ja huonot puolensa." Tiedemiehet ovat tietysti myös selvittämässä, kuinka valita oikea menetelmä tiettyä projektia varten. "Biokuvantamisen yhteydessä keskeisiä huomioitavia tekijöitä ovat: spatiaalinen ja ajallinen resoluutio, herkkyys valovaurioille, leimauskapasiteetti, näytteen paksuus ja taustafluoresenssi tai solun autologinen fluoresenssi." Kuinka se toimii Erilaiset superresoluutioiset mikroskoopit toimivat eri tavoin. PALM:n ja STORMin tapauksessa vain pieni osa fluoresoivista markkereista virittyy tai fotoaktivoituu tietyllä hetkellä, mikä mahdollistaa niiden itsenäisen paikantamisen suurella tarkkuudella. Tämän prosessin läpikäyminen kaikilla fluoresoivilla etiketeillä tuottaa täydellisen superresoluution kuvan. Stefan Hell, yksi vuoden 2014 kemian Nobel-palkinnon saajista ja Max Planck Institute of Biophysical Chemistry -instituutin johtaja, sanoi: "PALM/STORM-järjestelmä on suhteellisen helppo asentaa, mutta sitä on vaikea soveltaa, koska fluoresoiva valo Ryhmällä on oltava valoaktivointikyky. Rajoitukset Haittana on, että niiden on havaittava yksi fluoresoiva molekyyli solun yhteydessä, ja ne ovat vähemmän luotettavia kuin STED." STED käyttää laserpulssia fluoroforin virittämiseen ja renkaan muotoista laseria fluoroforin sammuttamiseen, jättäen vain nanometrin keskikokoisen fluoresenssin superresoluutioon. Koko näytteen skannaus tuottaa kuvan. "STEDin etuna on, että se on painiketekniikka", Hell selitti. "Se toimii kuin tavallinen konfokaalinen fluoresenssimikroskooppi." Se voi myös kuvata eläviä soluja käyttämällä fluoroforeja, kuten vihreitä tai keltaisia fluoresoivia proteiineja ja rodamiiniperäisiä väriaineita. Parametrien vertailu Vaikka kaikki superresoluutiotekniikat ylittävät tavanomaisen valomikroskopian resoluutioltaan, ne eroavat toisistaan. SIM karkeasti kaksinkertaistaa resoluution noin 100 nm:iin. PALM ja STORM voivat ratkaista 15 nm:n kohteita. Hellin mukaan STED tarjoaa spatiaalisen resoluution 30 nm elävissä soluissa ja 15 nm kiinteissä soluissa. Tietyissä sovelluksissa meidän on myös otettava huomioon signaali-kohinasuhde. Joissakin tapauksissa pienempi tarkkuus mutta korkeampi SNR voi johtaa parempaan kuvaan kuin päinvastoin (korkeampi resoluutio, mutta pienempi SNR). Kuvanoton nopeus on myös erittäin tärkeä, etenkin eläville soluille. "Kaikki superresoluutiotekniikat ovat hitaampia kuin perinteiset fluoresenssikuvaustekniikat", Stracy sanoi. "PALM/STORM on hitain, se tarvitsee kymmeniä tuhansia kehyksiä yhden kuvan saamiseksi, SIM tarvitsee kymmeniä kehyksiä ja STED on skannaustekniikka, joten kuvausnopeus riippuu näkökentän koosta." Elävien solujen tai kiinteiden kuvantamissolujen lisäksi jotkut tutkijat haluavat myös ymmärtää, kuinka esineet liikkuvat. Stracy on kiinnostunut ymmärtämään elävien solujen biologisten järjestelmien dynamiikkaa, ei vain staattisia kuvia. Hän yhdistää PALMin yksittäisten hiukkasten seurantaan analysoidakseen elävien solujen dynamiikkaa. Tällä tavalla hän voi seurata suoraan markkerimolekyylejä niiden suorittaessa tehtävänsä. Hän uskoo kuitenkin, että SIM ei sovellu näiden dynaamisten prosessien tutkimiseen molekyylitasolla, mutta nopean hankintanopeudensa ansiosta se soveltuu erityisen hyvin suurempien rakenteiden, kuten kokonaisten kromosomien, dynamiikan tarkkailuun. Viimeisimmät tulokset Vuonna 2017 Hellin tiimi raportoi MINFLUX-superresoluutiomikroskoopista Sciencessa. Hellin mukaan tämä superresoluutiomenetelmä saavuttaa ensimmäistä kertaa 1 nm:n avaruudellisen resoluution. Lisäksi se voi seurata yksittäisiä molekyylejä elävissä soluissa vähintään 100 kertaa nopeammin kuin muut menetelmät. Muut tutkijat puhuivat myös MINFLUX-mikroskoopista. "Uusia sovelluksia ja lähestymistapoja kehitetään jatkuvasti, mutta kaksi edistystä erottuu minusta", Shechtman sanoi. Yksi on MINFLUX. "Se käyttää nerokasta menetelmää erittäin tarkan molekyylien paikannukseen." Toisesta jännittävästä kehityksestä Shechtman mainitsi WE Moernerin ja hänen kollegansa Stanfordin yliopistossa. Moerner oli myös vuoden 2014 kemian Nobelin saaja. Yksi voittajista. Fluoresoivien yksittäisten molekyylien anisotrooppisen sironnan aiheuttaman kuvantamisen erottelukyvyn rajoituksen korjaamiseksi tutkijat käyttivät erilaisia virityspolarisaatioita molekyylien suunnan ja sijainnin määrittämiseksi. Lisäksi ne ovat kehittäneet herkät pupillipinnat. Nämä tekniikat parantavat kykyä lokalisoida rakenteita. Tietoja fluoresoivista tarroista Monissa superresoluutioissa tarroilla on todella merkitystä. Jotkut yritykset tarjoavat myös vastaavia tuotteita. Esimerkiksi saksalainen Miltenyi on tehnyt yhteistyötä Stefan Hellin perustaman Abberiorin kanssa tarjotakseen räätälöityjä vasta-ainekonjugaatiopalveluita superresoluutioisille mikroskopiaväreille. Useat muut yritykset tarjoavat myös vastaavia merkkejä. "Nano-Boosterimme ovat erittäin pieniä, vain 1,5 kDa ja erittäin spesifisiä", sanoo Christoph Eckert, ChromoTekin markkinointijohtaja. Nämä proteiinit sitovat vihreitä ja punaisia fluoresoivia proteiineja (GFP ja RFP). Ne on johdettu alpakan vasta-ainefragmenteista, jotka tunnetaan nimellä VHH tai nanobodit, joilla on erinomaiset sitoutumisominaisuudet ja vakaa laatu ilman erien vaihtelua. Nämä merkit sopivat erilaisiin superresoluutiotekniikoihin, mukaan lukien SIM, PALM, STORM ja STED. Ai-Hui Tang, Marylandin yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun apulaisprofessori, ja kollegat käyttivät ChromoTekin GFP-Boosteria ja STORMia tutkiakseen tiedon leviämistä hermostossa. He löysivät molekyylin nanoklustereita, joita kutsutaan nanokolumneiksi, presynaptisista ja postsynaptisista neuroneista. Tutkijat uskovat, että tämä rakenne osoittaa, että keskushermosto käyttää yksinkertaisia periaatteita synaptisen tehokkuuden ylläpitämiseksi ja säätelemiseksi. Erilaiset versiot superresoluutiokuvauksesta ja yhä useammat menetelmät vievät tutkijat entistä syvemmälle biologisiin mysteereihin. Rikkomalla näkyvän valon diffraktiorajaa biologit voivat jopa "seurata tarkasti" solujen toimintaa.
